02-基因工程制藥

1、第二章 基因工程技術制藥,,2024/3/22,1,一、概 述---幾個概念,,基因工程技術？,是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉入新的宿主細胞，構建成工程菌，實現遺傳物質的重新組合，并使目的基因在工程菌內進行復制和表達的技術。,2024/3/22,2,,基因工程藥物？,系指先確定對某種疾病具有預防和治療作用的蛋白質，然后將控制該蛋白質合成過程的基因分離、純化或進行人工合成，利用重組DNA技術加以改造，最后將該基因放入可以大量生產

2、的受體細胞中不斷繁殖，并能進行大規模生產具有預防和治療這種疾病的蛋白質，通過這種方法生產的新型藥物。,一、概 述---幾個概念,2024/3/22,3,,基因工程藥物上游階段？,主要是分離目的基因、構建工程菌（細胞）目的基因獲得后，最主要的就是目的基因的表達。選擇基因表達主要考慮的是保證表達的蛋白質的功能，其次是表達的量和分離純化的難易。此階段的工作主要在實驗室內完成。,一、概 述---幾個概念,2024/3/22,4,,基因工程藥物下

3、游階段？,從工程菌的大量培養一直到產品的分離純化和質量控制。此階段是將實驗室的成果產業化、商品化，主要包括工程菌大規模發酵最佳參數的確立，新型生物反應器的研制，高效分離介質及裝置的開發，分離純化的優化控制，高純度產品的制備技術，生物傳感器等一系列儀器儀表的設計和制造，電子計算機的優化控制等。,一、概 述---幾個概念,5,,制備基因工程藥物的一般程序,一、概 述,獲得目的基因,,組建重組質粒,,構建基因工程菌（或細菌）,,培養工程菌,,

4、除菌過濾,,半成品檢定,,包裝,6,,傳統制藥存在的問題,許多在疾病診斷、預防和治療中有重要價值的內源性活性物質（如激素、細胞因子、神經多肽、調節蛋白、酶類等人體活性多肽）以及某些疫苗，由于材料來源困難或者制造技術問題而無法研制出產品而付諸應用。 從動物臟器中提取出來（比如動物腦垂體中的一些肽類激素，包括腎上腺皮質激素、催產素起引產或催產作用，胃腸道類激素緩激肽等），也因造價太高，或來源困難而供不應求。,一、概 述,7,,傳統制藥存在

5、的問題,由于免抗原等緣故（由于酶的相對分子量較大，對人體可能具有抗原性，因此動物酶如作為注射用藥要經過大量的藥理實驗），使他們在使用上受到限制。在提取過程中難免有病毒感染，因此還可能會對病人造成嚴重后果。,一、概 述,2024/3/22,8,,基因工程技術的特點,就是能夠十分方便有效地生產許多以往難以大量獲取的生物活性物質，甚至可以創造出自然界中不存在的全新物質。它能從極端復雜的機體細胞內取出所需要的基因，將其在體外進行剪切拼接

6、、重新組合，然后轉入適當的細胞進行表達，從而生產出比原來多數百、數千倍的相應的蛋白質。,一、概 述,2024/3/22,9,,基因工程技術的特點,可大量生產過去難以獲得的生理活性多肽和蛋白質，為臨床使用提供有效的保障；可以提供足夠數量的生理活性物質，以便對其生理生化和結構進行深入的研究，從而擴大這些物質的應用范圍；利用基因工程技術可以發現、挖掘更多的內源性生理活性物質；內源性生理活性物質在作為藥物使用時存在的不足之處，可以通過

7、基因工程和蛋白質工程進行改造； 利用基因工程技術可以獲得新型化合物，擴大藥物篩選來源,一、概 述,10,,二、目的基因的獲得,從染色體中直接分離純化目的基因極為困難。 原核細胞不能直接克隆真核基因。,來源于真核細胞的產生基因工程藥物的目的基因，是不能進行直接分離的，原因有二：,2024/3/22,11,,二、目的基因的獲得,Ⅰ 逆轉錄法,目的克隆真核基因常用的方法有逆轉錄法和化學合成法：,DNA序列不含內含子,2024/3/22,

8、12,,二、目的基因的獲得,1 mRNA的純化,利用mRNA的3’末端含有polyA的特點，在RNA流經寡聚（dt）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度洗脫時，或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫下來，經過兩次寡聚（dt）纖維素柱后，可得到較高純度的mRNA。,2024/3/22,13,,二、目的基因的獲得,2 cDNA第一鏈的合成,一般mRNA都帶有3‘-poly A，所以可用寡聚d

9、T作為引物，在逆轉錄酶的催化下，開始cDNA鏈的合成。一次好的逆轉錄可使寡聚dT選出的mRNA有5%~30%被拷貝。,2024/3/22,14,,二、目的基因的獲得,3 cDNA第二鏈的合成,先用堿解或RHase酶解的方法除去cDNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈，然后以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈。雙鏈cDNA分子的大小常用變性瓊脂糖凝膠電泳進行測定。,2024/3/22,15,,二、目的基因的獲得,4 cDNA克隆,用于cDNA的

10、克隆載體有兩類：質粒DNA（如pUC、pBR322等）和噬菌體DNA（如λgt10、λgt10）等。根據重組后插入的cDNA是否能夠表達、能否經轉錄和翻譯合成蛋白，又將載體分為表達型載體和非表達型載體。在DNA克隆操作中應根據不同的需要選擇適當的載體。,16,,二、目的基因的獲得,5 將重組體導入宿主細胞,體外包裝的重組體感染受態宿主細胞。,2024/3/22,17,,二、目的基因的獲得,6 cDNA文庫的鑒定,cDNA文庫是指細胞中全

11、部mRNA反轉錄成cDNA并被克隆的總各。根據重組體的表型進行篩選，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑顏色改變法。然后采取凝膠電泳、分子雜交、DNA序列分析法等方法進行進一步篩選和鑒定。,2024/3/22,18,,二、目的基因的獲得,7 目的cDNA克隆的分離和鑒定,從cDNA文庫分離特異性cDNA克隆，主要采用下列兩種方法：1 核酸探針雜交法；2 免疫反應鑒定法。,19,,二、目的基因的獲得,Ⅱ反轉錄-聚合酶鏈反應法,1

12、985年聚合酶鏈反應（PCR）創立后，人們將它與反轉錄方法結合起來得到一種新的合成cDNA的方法，即反轉錄-聚合酶鏈反應法。 該方法是mRNA經反應轉錄合成cDNA第一鏈，不需要再合成cDNA第二鏈，而是在特異引物協助下，用PCR法進行擴增，特異性地合成目的cDNA鏈，用于重組、克隆。,20,,二、目的基因的獲得,Ⅲ 化學法,目的克隆真核基因常用的方法有逆轉錄法和化學合成法：,較小的蛋白質和多肽的編碼基因可以用人工化

13、學合成法獲得,合成目的基因DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進行退火連接成較長的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。,21,,二、目的基因的獲得,,人工化學合成基因的限制：A 不能合成太長的基因。最長50-60bp。只適用于克隆小分子肽的基因。B 人工合成基因時，遺傳密碼的簡并會為選擇密碼子帶來困難，如用氨基酸順序推測核苷酸序列，得到的結果可能與

14、天然基因不完全一致，易造成中性突變。C 費用太高。,2024/3/22,22,,三、目的基因的表達,基因表達 是指結構基因在生物體中的轉錄、翻譯以及所有加工過程?；蚋咝П磉_研究是指外源基因在某種細胞中的表達活動，即剪切下一個外源基因片段，拼接到另一個基因表達體系中，使其能獲得既有原生物活性又可高產的表達產物。,23,,三、目的基因的表達,基因表達研究的主要問題： 基因表達產量 表達產物的穩定性

15、 產物的生物學活性 表達產物的分離純化,2024/3/22,24,,三、目的基因的表達,① 容易獲得較高濃度的細胞；② 能利用易得廉價原料③ 不致病、不產生內毒素④ 發熱量低，需氧低，適當的發酵溫度和細胞形態⑤ 容易進行代謝調控⑥ 容易進行DNA技術操作⑦ 產物的產量、產率高，且易提取純化。,一、宿主細胞的選擇,2024/3/22,25,,三、目的基因的表達,原核細胞真核細胞,一、宿主細胞的選

16、擇,,大腸桿菌枯草芽孢桿菌鏈霉菌,,酵母絲狀真菌哺乳動物細胞,2024/3/22,26,外源基因在大腸桿菌中的表達,,2024/3/22,27,外源基因在大腸桿菌中的表達,,表達載體必須具備的條件,1. 載體能夠獨立的復制2. 具有靈活的克隆位點和方便的篩選標記。且克 隆位點應在啟動子序列后，以使克隆的外源基 因得以表達3. 具有很強的啟動子，能為大腸桿菌的RNA聚合 酶所識別4. 具有很強的阻

17、遏子，使啟動子受到控制，只有 當誘導時才能進行轉錄,2024/3/22,28,外源基因在大腸桿菌中的表達,,表達載體必須具備的條件,5. 具有很強的終止子，以便使RNA聚合酶集中力 量轉錄克隆的外源基因，而不轉錄無關的基因 同時很強的終止子所產生的mRNA較為穩定6. 所產生的mRNA必須具有翻譯的起始信號，即 起始密碼AUG和SD序列，以便轉錄后能順利翻 譯。,2024/3/22,29,外源基

18、因在大腸桿菌中的表達,,大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征,大腸桿菌表達外源基因的優勢：,全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架 基因克隆表達系統成熟完善 繁殖迅速、培養簡單、操作方便、遺傳穩定 被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物,2024/3/22,30,外源基因在大腸桿菌中的表達,,大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征,大腸桿菌表達外源基因的劣勢：,表達不存在信號肽，故產品多為胞內產物， 提取困難 缺乏對真

19、核生物蛋白的復性功能 缺乏對真核生物蛋白的修飾加工系統 易引起免疫反應 細胞周質內含有種類繁多的內毒素,2024/3/22,31,外源基因在大腸桿菌中的表達,,大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征,大腸桿菌作為外源基因的表達宿主，遺傳背景清楚，技術操作簡便，培養條件簡單，大規模發酵經濟，因此備受遺傳工程專家的重視。目前大腸桿菌是應用最廣泛、最成功的高效表達體系，并常常作為高效表達研究的首選體系。,2024/3/22,32,外源基

20、因在大腸桿菌中的表達,,外源基因在大腸桿菌中高效表達的原理,啟動子,終止子,,轉錄,核糖體結合位點密碼子質?？截悢?,翻譯,2024/3/22,33,外源基因在大腸桿菌中的表達,,啟動子,2024/3/22,34,外源基因在大腸桿菌中的表達,,啟動子,Lac 表達系統,以大腸桿菌lac操縱子調控機理為基礎設計、構建的表達系統轉錄調控機理,具有多順反子結構，基因排列次序為： 啟動子（lacP）-操縱基因（lacO）-結

21、構基因（lacZ-lacY-lacA） 正調節因子CAP 負調節因子lac1,2024/3/22,35,Lac 表達系統,正調節因子CAP,cAMP激活CAP，CAP-cAMP復合物與lac操縱子上專一位點結合后，能促進RNA聚合酶與-35、-10序列的結合，進而促進Plac介導的轉錄?；蚬こ讨惺褂玫膌ac啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即Plac UV5,,2024/3/22,36,Lac 表達系統,Lac UV5 突變體

22、,Plac UV5 突變體能夠在沒有CAP存在的情形下非常有效地起始轉錄，受它控制的基因在轉錄水平上只受lac1 的調控，因此用它構建的表達載體在使用時比野生型Plac更易操作。,,2024/3/22,37,Lac 表達系統,負調節因子 lac1,在無誘導情形下，lac1基因產物形成四具體阻遏蛋白，與啟動子下游的操縱基因緊密結合，阻止轉錄的起始。,,2024/3/22,38,Tac 表達系統,tac 啟動子是由trp的-35 序

23、列和lacUV5的-10 序列拼接 而成的雜合啟動子,調控模式與lacUV5相似，但mRNA 轉錄水平更高于trp 和lacUV5啟動子（P tac = 3 P trp = 11P lac），因此在要求 較高基因表達水平的情況下，選用tac 啟動子比用lacUV5 啟動子更優越。,,2024/3/22,39,Lac、tac啟動子對宿主菌的要求,在普通大腸桿菌中，Lac1阻遏蛋白僅能滿足細胞染色

24、 體上lac操縱子轉錄調控的需要。,當多拷貝的的lacO隨著帶有 lacUV5、tac啟動子的表達 質粒轉化進入大腸桿菌后，Lacl阻遏蛋白與lacO的比例 顯著下降，無法保證每一個lacO都能獲得足夠的Lacl阻 遏蛋白參與轉錄調控。表現為在無誘導物存在的情形下 ，lacUV5、tac 啟動子有較高的本地轉錄。,,2024/3/22,40,Lac、tac啟動子對宿主菌的要求,為了使以Lac

25、、Tac表達具有嚴緊調控外源基因轉錄的 能力，一種能產生過量的Lacl 阻遏蛋白的lacl 基因突變 體laclq被應用于表達系統。 大腸桿菌JM109等菌株的基因型均為lacq，常被選用為 Lac、Tac表達系統的宿主菌。 但是這些菌株也只能對低拷貝的表達載體實現嚴緊調 控，在使用高拷貝復制子的構建表達載體時，仍能觀 察到較高水平的本底轉錄。 需在表達載體中插入lacq基

26、因以保證有較多的Lacl阻遏 蛋白產生。,,2024/3/22,41,Lac、tac表達系統存在的問題,IPTG 用于誘導lac、tac啟動子的轉錄，但由于IPTG本身具有一定的毒性。從安全角度，對表達和制備用于醫療目的的重組蛋白并不適合。,一些國家規定在生產人用重組蛋白質的生產工藝中不能使用IPTG,解決方法,lac 和tac啟動子的轉錄受溫度嚴緊調控 乳糖替代IPTG誘導lac 和tac 啟動子的轉錄,,2024/3/2

27、2,42,Lac、tac表達系統存在的問題,Lac 和 tac 啟動子的轉錄受溫度嚴緊調控,把阻遏蛋白Lacl的溫度敏感突變體lacl(ts)、lacq(ts)插入表達載體或 整合到染色體后，均能使lac 和 tac啟動子的轉錄受到溫度嚴緊調控 在較低溫度（30℃）時抑制，在較高溫度（42 ℃ ）時開放。,用乳糖替代IPTG誘導 lac 和 tac 啟動子的轉錄,乳糖在β-半乳糖苷酶作用下生成異乳糖，異乳糖具有誘導劑

28、的作 用這一過程涉及乳糖的轉運和和轉化，其效率受到多種因素的影 響和制約，因此乳糖誘導的有效劑量大大高于IPTG。 乳糖本身作為一種碳源可以被大腸桿菌代謝利用，較多的乳糖存 在也會導致菌體生理及生長特性變化。乳糖替代IPTG作為誘導劑 的研究要與發酵工藝結合起來，才能顯示其良好的前景。,,2024/3/22,43,外源基因在大腸桿菌中的表達,,啟動子,Trp 表達系統,以大腸桿菌 trp 操縱

29、子調控機理為基礎設計、構建的表達系統轉錄調控機理,色氨酸啟動子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復合物的阻遏，轉錄 呈基底狀態。 在培養系統中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 變可有效地解除阻遏作用。 在正常的細菌培養體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因 工程中往往添加IAA誘導Ptrp 介導的目的基因表達。,2024/3/22,44,Trp 表達系統,,2024/3/22,45,外源基因在大腸

30、桿菌中的表達,,啟動子,PL 和 PR 表達系統,以λ噬菌體早期轉錄啟動子PL、PR為核心構建的表達系統在野生型 λ 噬菌體中，PL、PR啟動子轉錄與否決定了λ 噬菌體進入了裂解循環還是溶源循環。,2024/3/22,46,PL 和 PR 表達系統,轉錄調控的機理,由λ噬菌體PE啟動子控制的cl基因的產物是PL、PR啟動子轉錄的阻遏物 。cl 基因的產物在大腸桿菌宿主中的濃度取決于一系列宿主與噬菌體因子之間的錯綜復雜的平衡關

31、系。由于通過細胞因子來控制 cl 基因產物的產生和消失是相當困難的。因此PL、PR表達系統都選用溫度敏感突變體cl 857 (ts)的基因產物來調控PL、PR啟動子的轉錄。 在較低溫度下（30℃）時以活性形式存在 在較高溫度（42℃ ）時失活脫落,,2024/3/22,47,PL 和 PR 表達系統,宿主菌中沒有cl基因產物，PL、PR啟動子的高強度直接轉錄，帶有PL或PR啟動子的表達載體在普通大腸桿菌中相當不穩定,對宿

32、主菌的要求,用溶源化λ噬菌體的大腸桿菌作PL、PR啟動子表達載體 的宿主菌N4830-1，POP2136等菌株已經溶源化cl 857(ts) λ噬菌體，可用作表達外源基因時的宿主菌。 把 cl 857 (ts) 基因組裝在表達載體上 宿主菌選擇范圍更大,,2024/3/22,48,PL 和 PR 表達系統存在的問題,由于PL和PR表達系統誘導時不加化學誘導劑，成本又低廉，最初幾個在大腸桿菌中制

33、備的藥用重組蛋白質都采用PL或PR表達系統。,缺陷,在熱脈沖誘導中，大腸桿菌熱休克蛋白的表達也會被激 活，其中一些是蛋白質水解酶，有可能降解所表達的重 組蛋白。 在大體積發酵培養菌體時，通過熱平衡交換方式把培養 溫度提高到42℃需要較長的時間，這種緩慢的升溫方式影 響誘導效果，對重組蛋白表達量有一定的影響。,,2024/3/22,49,T7表達系統,大腸桿菌T7噬菌體具有一套專一性非常強的轉

34、錄體系，利用這一體系中的元件為基礎構建的表達系統稱為T7表達系統。,,2024/3/22,50,T7表達系統,T7噬菌體基因1編碼的T7 RNA聚合酶選擇性激活 T7 噬菌體啟動子的轉錄。 T7 RNA 聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大腸桿 菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以轉錄某些不能被大腸 桿菌RNA聚合酶有效轉錄的序列。 在細胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌體啟動子的情形 下，大腸桿菌

35、宿主本身基因的轉錄競爭不過T7噬菌體轉 錄體系，最終T7噬菌體啟動子控制的基因的轉錄達到很 高的水平。,,2024/3/22,51,T7表達系統,轉錄調控的機理,T7 噬菌體啟動子的轉錄完全依賴于T7 RNA聚合酶，因此 T7 RNA聚合酶的轉錄模式就決定了表達系統的調控方式。,化學誘導型溫度誘導型雙質粒系統,,2024/3/22,52,T7表達系統,轉錄調控的機理,化學誘導型,噬菌體DE3 是λ噬菌體的衍生株，

36、一段含有lacl、lacUV5啟動子和T7 RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其int 基因中用噬菌體DE3作為表達載體的宿主菌，調控方式為化學誘導型，類似于Lac表達系統。,,2024/3/22,53,T7表達系統,轉錄調控的機理,溫度誘導型,PL啟動子控制 T7 RNA 聚合酶基因，通過熱誘導方式激發T7噬菌體啟動子的轉錄。這種方式可以使本底轉錄酶降到很低的水平，尤其適用于表達對大腸桿菌宿主有毒性的重組蛋

37、白質。,,2024/3/22,54,T7表達系統存在的問題,T7表達系統表達目的基因的水平是目前所有表達系統中最高的，但也不可避免出現在相對較高的本底轉錄，如果目的基因產物對大腸桿菌宿主有毒性，會影響細胞的生長。,解決辦法之一,因為T7溶菌酶除了作用于大腸桿菌細胞壁上肽聚糖外，還 能與T7 RNA聚合酶結合抑制其轉錄的活性。 目前T7 溶菌酶基因都通過共轉化質粒導入表達系統，它能 明顯降低本底轉錄，但對誘導后目的的

38、基因的表達水平無 明顯影響。,,2024/3/22,55,其他表達系統,營養調控型,采用大腸桿菌堿性磷酸酯酶基因phoA啟動子或甘油3‘- 磷酸轉移系統ugp啟動子構建表達載體。 這兩個啟動子受在培養基中的無機磷（Pi）濃度調控 （Pi﹥ 5mmol/L 時抑制，Pi﹤1mmol/L 時激活），具有 較高的轉錄水平。,,2024/3/22,56,其他表達系統,糖原調控型,采用的有大腸桿菌半乳糖轉移系

39、統（mg1BAEC）mgl啟動 或沙門氏菌阿拉伯糖基因araB啟動構建表達載體。 這兩個啟動子受葡萄糖抑制，巖藻糖和阿拉伯糖是它們的 誘導物。其調控機理類似于Lac表達系統。,,2024/3/22,57,其他表達系統,pH調控型,采用大腸桿菌賴氨酸脫羧酶基因cadA 啟動子構建表達載 體。 cadA啟動子受培養基中H+濃度，即pH值調控。（在 pH﹥8時抑制，pH﹤6時激活，pH = 6 時

40、轉錄活力最高）。 該表達系統要求菌體發酵溫度控制在27~30℃之間才能使 目的基因得到穩定的表達。,,2024/3/22,58,其他表達系統,溶氧調控型,采用大腸桿菌丙酮酸甲酸裂解酶基因 pfl 啟動子，硝基還 原酶基因nirB啟動子或透明顫菌血紅蛋白基因 vgb 啟動子 構建表達載體。這些啟動子中都含有對氧響應的調節因子 fnr的作用位點。 在富氧條件下轉錄被抑制，在貧氧或微生物條件下轉錄被

41、 激活。,,2024/3/22,59,其他表達系統,溶氧調控型,大腸桿菌 GJ100 有透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）啟動子 控制下的T7 RNA 聚合酶基因表達質粒，vgb 基因的轉錄 是受環境溶氧濃度調控的，在貧氧條件下vgb 基因的啟動 子被激活。 因此，用大腸桿菌GJ100作為宿主時，表達系統調控方式 為貧氧誘導型，菌體發酵時的溶氧濃度可以通過控制攪拌 轉速和通氣量加以

42、調節，與其他調控模式相比更適合于產 業化生產過程。,,2024/3/22,60,其他表達系統,生物素調控型,用大腸桿菌生物素操縱子及其調控區構建表達載體，而菌 體生長過程中生物素會不斷消耗，當濃度到達2ng/ml以下 時啟動子被激活。 能夠在沒有外界的物理，化學信號的介入條件下自動誘導 表達目的基因時這類表達載體的特點，其缺陷是不容易精 確控制自動誘導的時刻。,,61,終止子,強化轉

43、錄終止的必要性,外源基因在強啟動子的控制下表達，容易發生轉錄過頭現象，即RNA聚合酶滑過終止子結構繼續轉錄質粒上鄰近的DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物，過長轉錄物的產生在很大程度上會影響外源基因的表達，其原因如下： 轉錄產物越長，RNA聚合酶轉錄一分子mRNA所需的時間就相應增 加，外源基因本身的轉錄效率下降。 如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區域， 如選擇性標記基因和復制子結構等

44、，則RNA聚合酶在此處的轉錄可 能干擾質粒的復制及其它生物功能，甚至導致重組質粒的不穩定性。 過長的mRNA往往會產生大量無用的蛋白質，增加工程無謂的能量 消耗。 更為嚴重的是，過長的轉錄物往往不能形成理想的二級結構，從而 大大降低外源基因編碼產物的翻譯效率。,,2024/3/22,62,終止子,強終止子的選擇與使用,目前外源基因表達質粒中常用的終止子是來自大腸桿菌 rRNA操縱子上的rrn

45、T1T2以及T7噬菌體DNA上的TΦ。,對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w 終止子串聯的特殊結構，以增強其轉錄終止作用。,,2024/3/22,63,核糖體結合位點,核糖體結合位點,外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關。 大腸桿菌細胞中結構不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數百倍。

46、 mRNA 翻譯的起始效率主要由其5’端的結構序列所決定，稱為核糖體結合位點（RBS）,,2024/3/22,64,2024/3/22,65,核糖體結合位點,核糖體結合位點,大腸桿菌核糖體結合位點包括下列四個特征結構要素： 位于翻譯起始密碼子上游的6-8個核苷酸序列5‘UAAGG AGG 3’即Shine-Dalgarno（SD）序列，他通過識別大腸桿 菌核糖體小亞基中的16S rRNA 3’端區域3‘AUU

47、CCUCC 5’ 并與之專一性結合將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻 譯； 翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀 框架的起始位點，有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯 起始密碼子 SD 序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成 基因編碼區5’端若干密碼子的堿基序列,,2024/3/22,66,核糖體結合位點,核糖體結合位點對外源基因表達的影響,SD序列的影響,一般來說m

48、RNA與核糖體的結合程度越強，翻譯的起始效率就越高，而這種結合程度主要取決于SD（UAAGGAGG）序列與16S rRNA 的堿基互補性，其中以GGAG四個堿基序列尤為重要。對多數基因而言，上述四個堿基序列尤為重要。對多數基因而言，上述四個堿基中任何一個換成C或T，均會導致翻譯效率大幅度降低。,,2024/3/22,67,核糖體結合位點對外源基因表達的影響,SD序列與起始密碼子之間的序列影響,SD序列下游堿基若為AAAA或UU

49、UU，翻譯效力最高； 而CCCC或GGGG 的翻譯效率則分別最高值的50%和25%。 緊鄰AUG的前三個堿基成份對翻譯起始也有影響。 對于大腸桿菌β-半乳糖苷酶的mRNA 而言，在這個位置 上最佳的堿基組合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或 AGG取代之，則酶的表達水平低20倍。,,核糖體結合位點,2024/3/22,68,核糖體結合位點對外源基因表達的影響,SD序列與起始密碼子之間的距離的影

50、響,SD序列與起始密碼子AUG之間的精確距離保證了mRNA 在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖 體復合物結構中的P位，這是翻譯啟動的前提條件。 在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七個堿基處， 在此間隔中少一個堿基或多一個堿基，均導致翻譯起始 效率不同程度的降低。,,核糖體結合位點,2024/3/22,69,核糖體結合位點對外源基因表達的影響,起始密碼子及其后續若干密碼子的影

51、響,大腸桿菌中的起始tRNA 分子可以同時識別AUG、GUG 和UUG三種起始密碼子，但其識別頻率并不相同，通常 GUG為AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。 除此之外，從AUG開始的前幾個密碼子堿基序列也至關 重要，至少這一序列不能與mRNA 的5‘端非編碼區形成 莖環結構，否則便會嚴重干擾mRNA在核糖體上的準確 定位。 目前廣泛用于外源基因表達的大腸桿菌表達型質粒上，

52、 均含有與啟動子來源相同的核糖體結合位點序列，序列 和間隔是最佳的。,,核糖體結合位點,2024/3/22,70,密碼子,生物體對密碼子的偏愛性,不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性，其決定因素是：,生物基因組中的堿基含量在富含AT的生物（如單鏈DNA噬菌體ΦX174）基因組中，密碼子第三位上的U和A出現的頻率較高；在GC豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，

53、第三位上含有G或C的簡并密碼子占90%以上的絕對優勢,,2024/3/22,71,密碼子偏愛性對外源基因表達的影響,由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程度的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。,一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼在大腸桿菌細胞中獲得最佳表達： 外源基因全合成 同步表達相關tRNA編碼基因,,密碼子,2

54、024/3/22,72,質?？截悢?質?？截悢祵毦L代謝的影響,目前實驗室里廣泛使用的表達型質粒在每個大腸桿菌細菌中可達數百甚至上千個拷貝，質粒的擴增過程通常發生在受體細胞的對數生長期內，而此時正是細菌生理代謝最旺盛的階段。質粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達勢必會影響受體細胞的生長代謝，進而導致重組質粒的不穩定性以及目的基因宏觀表達水平的下降。解決上述難題的一種有效策略是將重組質粒的擴增納入可控制的軌道,,2

55、024/3/22,73,外源基因在大腸桿菌中的表達,,蛋白質的合成是在細胞之中進行的,目標蛋白在細胞質中表達的主要優點是：,表達質粒的構建比較簡單； 能夠達到很高的目標蛋白表達量，一般可以達到占細胞 總蛋白的20%~40%。,目標蛋白在大腸桿菌系統表達的形式有兩種：,在細胞內表達為不溶性的包涵體顆粒 包涵體存在于大腸桿菌細胞質中 在細胞內表現為可溶性的蛋白質 可溶性的蛋白質除可存在于細胞質中外，還可借助于本身 的功能

56、序列和大腸桿菌蛋白質加工、運輸體系，最終分泌 到周質空間，或分泌到培養液中。,2024/3/22,74,外源基因在大腸桿菌中的表達,,大腸桿菌基因工程菌的構建策略,包涵體型異源蛋白的表達分泌型異源蛋白的表達融合型異源蛋白的表達寡聚型異源蛋白的表達整合型異源蛋白的表達蛋白酶抗性或缺陷性表達系統的構建,2024/3/22,75,包涵體性異源蛋白的表達,包涵體及其性質,在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致

57、密地集聚在細胞內，或被膜包裹或形成無膜裸露結構，這種水不溶性的結構稱為包涵體（Inclusion Bodies，IB） 富含蛋白質的包涵體多見于生長在含有氨基酸類似物培養基的大腸桿菌細胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質往往會喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。 由高效表達質粒構建的大腸工程桿菌大量合成非天然的同源或異源蛋白質，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細菌細胞內。

58、 除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白質分子,,2024/3/22,76,以包涵體形式表達目的蛋白的優缺點,包涵體表達形式的優點在一定程度上保持表達產物的結構穩定能夠避免細胞內蛋白質水解酶的作用，有利于目標蛋白的富集簡化外源基因表達產物的分離操作包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌體經超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來能夠表達對大腸桿菌宿主有毒或有

59、致死效應的目標蛋白,,包涵體性異源蛋白的表達,2024/3/22,77,以包涵體形式表達目的蛋白的優缺點,包涵體表達形式的缺點 以包涵形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復性操作，才能回收得到具有正確空間構象（因而具有生物活性）的目標蛋白，因此包涵體變性復性操作的效率對目標產物的收率至關重要。 經過復性處理的目標蛋白不一定能完全恢復原來的生物學活性，有時甚至完全得不到有活性的蛋白

60、，尤其當目標蛋白分子中的Cys殘基數目較高時，體外復性蛋白的成功率相當低，一般不超過30%,,包涵體性異源蛋白的表達,2024/3/22,78,包涵體的變性與復性操作,包涵體的溶解與變性 包涵體的溶解與變性的主要任務是拆開錯配的二硫鍵和次級鍵。在人工條件下，使包涵體溶解并重新進入復興途徑中。,,能有效促進包涵體溶解變性的試劑和條件包括：清 洗 劑 SDS、正十二醇肌氨酸、廉價，但影響復性和純化促 溶 劑 鹽酸

61、胍，尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發 形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應混合溶劑 如尿素與醋酸、二甲基砜等聯合使用，溶解力增強極 端 pH 廉價、但許多蛋白質在極端pH條件下發生修飾反應,包涵體性異源蛋白的表達,2024/3/22,79,包涵體的變性與復性操作,包涵體的復性與重折疊（refolding）,,,包涵體的復性與重折疊的主要任務 將多肽鏈中被拆開的

62、游離巰基重新折疊 通過次級鍵的形成使蛋白質復性,包涵體性異源蛋白的表達,2024/3/22,80,,,這是因為大腸桿菌細胞質微環境的氧化還原態勢不利于蛋白質二硫鍵的形成，而且缺少一種形成二硫鍵所必須的體系。一些需要通過二硫鍵的形成來維持其構象的目標蛋白在大腸桿菌的細胞質中往往不能正確折疊。 解決這一問題的途徑之一是用大腸桿菌氧硫還蛋白還原酶基因trxB缺陷株作為宿主菌表達目標蛋白

63、。研究表明trxB缺陷株細胞質中能夠形成二硫鍵。這一菌株對于表達結構復雜的蛋白質而言是一個相當重要的工具。,包涵體性異源蛋白的表達,2024/3/22,81,分泌型異源蛋白的表達,在細胞內表現為可溶性的蛋白質,,,目標蛋白以可溶性蛋白質形式表達雖然可以避免包涵體復性帶來的問題，但是也有一定的缺陷，主要表現為大腸桿菌本身存在于細胞質中的蛋白質往往只含有少量的，甚至沒有半胱氨酸殘基。富含半胱氨酸殘基，需要形成二硫鍵的蛋白質大部分

64、被轉運到細胞的其他部位。,2024/3/22,82,在細胞質中直接表達不帶有前導序列的成熟蛋白質,,,在細胞質中直接表達不帶有前導序列的成熟蛋白質需要起始密碼，通常為編碼甲硫氨酸的 ATG。 ⑴ 在多數情況下，N端附加的甲硫氨酸對蛋白質的性質沒有特別的影響，但是也有附加的甲硫氨酸嚴重影響蛋白質生物活力的報道。 ⑵ 另外，附加的甲硫氨酸也可能改變蛋白質的免疫性質和藥理性質。從制備用于醫療目的的蛋白質

65、的角度來看，這是一個需要引起重視的問題。,2024/3/22,83,,,去除附加的甲硫氨酸有兩種方法：,⑴ 在表達系統中共表達甲硫氨酸氨肽酶基因。⑵ 在分離純化后在體外用外肽酶處理。但它們都對與甲硫氨酸相鄰的氨基酸殘基類型有一定要求，因此在使用上有一定的限制。,2024/3/22,84,目標蛋白與有親合配基的序列融合表達,,,與純化包涵體相比，細胞質中以可溶性形式表達蛋白質的分離純化過程比較復雜，一般要通過親合層析才能達到比

66、較高的純度。 目標蛋白與有親合配基的序列融合表達既可以提高分離純化的效率，又能在融合蛋白切離的過程中得到沒有附加甲硫氨酸目標蛋白。 金黃色葡萄糖球菌蛋白G、A和衍生物7，日本血吸蟲谷胱甘肽-S-轉移酶，大腸桿菌麥芽糠結合蛋白，His-tag等是目前常用的與目標基因融合表達的序列。,2024/3/22,85,目標蛋白在周質空間中表達,,,目標蛋白在周質空間中表達的優點,大腸桿菌周質空間中自身蛋白質的

67、數量約為100種，只占 菌體總蛋白數量的4%。蛋白質水解酶的含量與在細胞中 相比也少得多，因此目標蛋白在周質空間中表達有利于分 離純化和減少蛋白水解酶的降解。目標蛋白從細胞質轉運到周質空間過程中信號肽被加工切 除，有效地避免了N端附加的甲硫氨酸的產生。周質空間中呈氧化型的氧化還原態勢使目標蛋白能夠較好 折疊，維持正確的構象。,2024/3/22,86,目標蛋白外泌表達,,,把所表達的

68、目標蛋白外泌到細胞外的培養基中可以進一步減少蛋白水解酶的降解，也有利于分離純化。 目前成功的例子主要是采用以下方案： 與大腸桿菌本身的外泌蛋白基因融合表達 與一些能提高細胞外膜通透性的因子融合或共表達 改變培養基的成分 歸納現有的研究結果顯示這些方法僅對外泌分子量較小的蛋白質有效，而且外泌效率一般都比較低。,2024/3/22,87,高效表達目標基因的戰略和技術,,,表達質粒的優化和設計共表達