重組鹽生杜氏藻雙功能域3-磷酸甘油脫氫酶的表達純化和部分酶學性質研究.pdf

1、鹽生杜氏藻Dunaliella salina(簡稱鹽藻)是一種抗鹽能力很強的單細胞綠藻，具有極強的滲透調節能力。甘油是它的主要滲透調節物質。杜氏藻細胞內有一條專門的調節滲透壓的代謝途徑，即甘油循環代謝途徑，它能對外界鹽濃度變化作出迅速反應，調節胞內甘油濃度以使細胞內外達到滲透平衡。3-磷酸甘油(G-3-P)脫氫酶是甘油循環中的第一個酶，在其中起重要的調節作用。因此研究杜氏藻G-3-P脫氫酶的性質具有重要意義。 實驗室在前期工作中

2、已獲得鹽藻Osm-GPD的全長基因，生物信息學分析表明該基因結構相對于其它物種的GPD基因而言非常特殊，即同時具有兩個功能結構域：GPD Domain和SGPP Domain。本研究在對具有雙功能域的重組鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶的表達條件優化和純化的基礎上，對其性質進行了初步研究。 1、表達條件的優化 通過降低誘導溫度和改變誘導劑濃度濃度的方法;在30℃，O.3mmol/LIPTG的條件下，誘導工程菌株BL2l(DE

3、3)/pET32-GPD1.9，目的蛋白質重組鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶以可溶蛋白的形式存在于上清中。 2、重組鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶的純化 將酶粗提液經Chelating F.F.金屬螯合層析，透析，腸激酶酶切，ChelatingH.P．金屬螯合層析等步驟，分離純化了重組3-磷酸甘油脫氫酶，SDS-PAGE結果都顯示出一條帶，GPD(逆向)比活性為192U/mg，GPP比活性為4440U/mg；SDS-聚丙烯酰

4、胺凝膠電泳測得相對分子質量為60KDa。 3、酶活性影響因素的測定 重組3-磷酸甘油脫氫酶GPD功能域逆向酶活性的最適溫度為37℃，最適pH為10.0；GPP功能域酶活性的最適溫度50℃，最適pH為7.0；關于鹽對該酶的活性影響。低濃度的NaCI(0.05 mol／L)對重組3-磷酸甘油脫氫酶活力略有保護作用。但高濃度NaCl(0.15 mol/L，0.5 mol/L)對酶有一定的抑制作用，并能加快酶的失活，而且濃度越高

5、效應越明顯，含0.5mol/L NaCI的酶液保存2 d活力全部喪失。 4、重組3-磷酸甘油脫氫酶動力學研究 通過動力學方法測得重組3-磷酸甘油脫氫酶GPD功能域在25℃，pH為10.0條件下，以3-磷酸甘油和NAD<'+>為底物，Km (G3P)為4.21mmol/L Km(NAD<'+>)為2.57mmol/L。重組3-磷酸甘油脫氫酶GPP功能域在25℃，pH為7.0條件下，以3-磷酸甘油為底物，Km(G3P)為1.