單堿基多態性和蛋白質的檢測新方法研究.pdf

1、基因片段的變異與基因疾病的產生有密切的關系，其中單堿基多態性是最常見的遺傳變異。單堿基多態性的精確、靈敏和特異性檢測已經成為全社會關注的問題，并且有望在DNA診斷中起到至關重要的作用。蛋白質是一類重要的生物標志物，它的分析檢測在生物學、醫學診斷等領域具有非常重要的意義。本論文致力于單堿基多態性和蛋白質的檢測新方法研究，完成了三項工作，實現了對目標物的快速、靈敏、準確檢測。主要內容如下：
　　 1.利用適配子-血紅素的復合物能夠模

2、擬辣根過氧化酶的生物活性，催化魯米諾和雙氧水的化學發光反應的特性，提出了一種基于連接酶檢測反應和等溫擴增反應的化學發光檢測方法，用于單堿基多態性的檢測
　　 【第2章】。對于完全匹配的雜交體，通過連接酶檢測反應，產生大量的探針連接產物，但對于單堿基錯配的雜交體，連接酶不起連接作用。連接產物由于在DNA聚合酶和限制性內切酶的共同作用下，發生等溫擴增反應，擴增出大量的血紅素的適配子，適配子與血紅素結合，形成的復合物催化魯米諾和雙氧水

3、的化學反應。在一定范圍內，化學發光的強度與目標鏈濃度成正比，從而實現單堿基多態性的定量檢測，檢測下限達到1 pM.我們用該方法對細胞色素P450酶系中的異喹胍羥化酶的單堿基多態性(CYP2D6*10)進行了檢測，使突變型和野生型基因DNA得到了很好的區分。
　　 2.基于類似的原理，將上述方法改進發展，實現了單堿基多態性更靈敏、更快速的分析檢測
　　 【第3章】。分析過程包括兩個并行合作的等溫擴增反應，第一步等溫擴增產生

4、的核酸鏈可以作為第二步等溫擴增的引物，引發第二步等溫擴增，產生了大量的血紅素的適配子，通過檢測適配子-血紅素復合物催化產生的化學發光的強度，定性定量檢測單堿基多態性。
　　 3.適配子傳感技術與臨近雜交、體外轉錄相結合，建立了一種新的蛋白質熒光檢測方法
　　 【第4章】。當溶液中沒有凝血酶時，由于兩條探針尾端的互補序列很短，所形成的雜交體的熔鏈溫度很低，在反應溫度下，極不穩定。然而當溶液中存在凝血酶的時候，適配子探針與凝