基于生物活性多肽及蛋白的電化學研究.pdf

1、電化學方法具有快速、靈敏和操作簡單等優點，由于大多數多肽或蛋白質不具有電化學活性，阻礙了電化學方法在生物化學領域的應用。通過電活性標記物的引入，可使本身不具有電活性或在電極表面電子傳遞速率較慢的多肽或蛋白具有電化學活性。在生命過程中的許多生理現象與電流或電勢的變化密切相關。因此，研究生物組分的氧化還原特性對探討疾病的致病機理、研發新型藥物等具有重要的意義?；谏鲜隹紤]，本論文的主要內容有：
　　 (1)以二茂鐵甲酸為起始原料，采

2、用液相合成法得到具有電活性的還原型谷胱甘肽.二茂鐵(GSH-Fc)，總收率為12.5％。利用電化學方法研究了GSH-Fc與BSA的相互作用，結合比和結合常數分別為1.41±0.06和6.53±2.01×106 L·mol-1，結合位點位于BSA的subdomain IIA。利用熒光光譜方法驗證了電化學方法的可靠性，同時熒光方法表明GSH-Fc與BSA結合以疏水作用和氫鍵為主。利用電化學方法研究了GSH-Fc與金屬硫蛋白(MT)的相互作用

3、。實驗結果表明GSH-Fc在Zn7-MT修飾金電極上有一對很好的氧化還原峰，Epa=0.218 V，Epc=0.154 V，△Ep=64 mV，Ipa/Ipc=1.03。而GSH-Fc在裸金電極上的氧化還原電位分別為Epa'=0.205 V和Epc’=0.147 V，△Ep'=58 mV，Ipa’/Ipc’=1.02，說明MT與GSH-Fc之間具有特殊相互作用，結合比和結合常數分別為1.78±0.15和5.54±0.43×108 L·m

4、ol-1，在GSH-Fc(或GSH)和GSSG共存的溶液中，Zn(Ⅱ)可以從MT分子中釋放。
　　 (2)構建了11-二茂鐵基十一烷基-1-硫醇(FcC11SH)和聚丙烯酰胺包覆的過氧化氫酶(HRP)混雙分子膜修飾電極實現過氧化氫(H2O2)的微量檢測。通過調整組裝HRP的硫醇鏈長以及FcC11SH介體，電子能在FcC11SH和HRP之間轉移。該電極安培檢測H2O2最低濃度為0.64 nmol·L-1，檢測動態范圍寬。HRP的包

5、覆沒有影響電子的傳遞以及H2O2的擴散，更重要的是通過與未包覆的酶電極、商業化的無線HRP/polymer電極對比，包覆后的酶能有效的提高酶的穩定性，在3星期后，酶的活性能保持90％，且能有效的防止介體的滲漏。此外，FcC11SH/包覆的HRP電極能快速測定樣品中H2O2的濃度，具有較好的重現性。采用FcC11SH和葡萄糖氧化酶(GOD)混雙分子膜電極研究了第二代酶傳感器，由于FcC11SH電位比較高，因此在實際樣品檢測時，許多電活性物

6、質如抗壞血酸(AA)、尿酸(UA)和對乙酰氨基酚(ACP)容易氧化，對結果造成干擾。利用網狀玻璃碳(RVC)材料的高表面積以及高電流密度設計一種全新的葡萄糖傳感器檢測裝置。通過聯用FcC11SH和GOD混雙分子膜組裝的薄層電極，葡萄糖的濃度在0.05～40 mmol·L-1之間呈現良好的線性關系，檢測限為3.6μmol·L-1。通過調整流動注射的流速和RVC電極的電位，具有電活性物質基本上完全被氧化，且氧化后的產物對酶電極不會產生干擾信

7、號。應用該裝置實現了實際樣品的實時在線檢測。
　　 (3)阿爾茨海默氏病(AD)是一種神經退行性疾病，主要病因是病人大腦中β-淀粉樣肽(amyloidβ-peptide，Aβ)的異常聚集，因此抑制Aβ的異常聚集能有效的延緩或治療老年癡呆癥。大量研究表明Lys-Leu-Val-Phe-Phe(KLVFF)五肽序列能夠與Aβ結合從而阻止Aβ的聚集。但KLVFF水溶性及脂溶性差，易被酶解。因此，采用固相合成法合成了二茂鐵標記的水溶性較

8、好的阻斷肽Fc-KLVFFK6，該阻斷肽含有能與Aβ識別并阻斷Aβ形成纖維的疏水性片段。利用二茂鐵的電化學活性研究了該阻斷肽對Aβ聚集的動力學，表明Fc-KLVFFK6能較好的阻斷Aβ纖維的聚集，同時利用熒光光譜和原子力顯微鏡研究了Fc-KLVFFK6和KLVFFK6抑制Aβ纖維的聚集，結果和電化學方法一致。
　　 (4)帕金森病(PD)是第二大最常見的神經退行性疾病，主要特征是多巴胺能神經元細胞的丟失引起多巴胺的缺乏，以及金屬

9、離子(Cu和Fe)沉積，目前致病機理尚未清楚。α-syn在PD的神經病理中具有重要的作用，能與Cu(Ⅱ)，Zn(Ⅱ)和Fe(Ⅱ)結合，因此本研究利用質譜分析了α-syn與Fe(Ⅱ)相互作用，證明α-syn與Fe(Ⅱ)相互作用能形成1:1的配合物，該配合物的氧化電位和還原電位分別為0.143 V和-0.093 V，根據能斯特方程，α-syn-Fe(Ⅲ)的平衡常數KA為1.2×1013L·mol-1。由于Fe(Ⅲ)溶度積常數Ksp為1.0×

10、10-38，在生理條件下α-syn-Fe(Ⅲ)不穩定，容易水解，且α-syn與Fe(Ⅱ)結合后，在空氣中能與O2反應生成H2O2。通過熒光光譜方法驗證了H2O2生成，并探討了α-syn與Fe(Ⅱ)結合后在PD中的誘導的氧化應激步驟、α-syn的聚集以及在細胞內Fe(Ⅱ)的傳遞。Cu(Ⅱ)能加速α-syn的聚集形成不同神經毒性的聚集，然而Cu(Ⅱ)是具有氧化還原活性，而Cu(Ⅱ)和許多蛋白或多肽形成的配合物與神經退行性疾病的氧化步驟相關。

11、因此，在本研究中，合成了α-syn的兩個具有與Cu(Ⅱ)結合較強的片段：α-syn(1-19)和α-syn(20-50)，利用質譜分析了α-syn，α-syn(1-19)和α-syn(20-50)與Cu(Ⅱ)相互作用，表明α-syn及其片段多肽能和Cu(Ⅱ)形成配合物，并利用電化學方法研究了其電化學行為，其標準氧化還原電位分別為0.04 V，0.072 V和0.025 V，在O2存在的條件下能催化O2的還原，生成H2O2，且抗壞血酸(A