基于核酸修飾電極的新型電化學生物傳感器.pdf

1、快速、廉價、高靈敏度和高選擇性檢測生命活動相關的蛋白質與小分子、疾病相關的特征DNA序列以及環境毒性污染物是現代生物化學分析的重要課題，這一多學科的共性目標促使了生物傳感器的出現和發展。電化學核酸傳感器是一類以核酸分子作為識別元素，以電極作為信號轉換器的生物傳感器。核酸分子探針具有結構簡單、特異性強、靶物質分子廣泛和易于大量商業化合成的優點。電化學核酸傳感器結合了核酸探針的優異性能和電化學檢測方法的高靈敏度特性，在現代生物傳感器研究領域

2、中處于主體地位。核酸探針在電極表面的穩定固定、探針與目標分子間的有效識別以及識別事件的靈敏電化學信號轉換，是構建高性能電化學核酸傳感器的三個關鍵問題。此外，發掘核酸修飾電極的新性能、設計與制備新型核酸探針，對于擴大電化學核酸傳感器的應用范圍和開發新型高效傳感系統具有重要的意義。本論文圍繞這些電化學核酸傳感器研究中的共性問題，在核酸修飾電極的新用途、核酸探針固定新方法和高靈敏度信號轉換方法以及新型核酸探針設計等方面開展了一系列的研究工作，

3、主要內容如下：
　　 (1)多巴胺在電沉積DNA修飾電極表面的電催化氧化檢測雙鏈DNA是一種具有規則雙螺旋結構的陰離子聚合物，廣泛用作合成導電聚合物和金屬納米材料的分子模板。第2章的研究工作采用一步電沉積的方法將小牛胸腺DNA沉積于玻碳電極表面制成表面負電性的DNA修飾電極。修飾電極表面的負電性DNA分子層對中性pH值溶液中正電性的多巴胺分子表現出明顯的靜電吸附富集作用，可顯著增強多巴胺分子的直接電化學氧化電流；同時該電沉積DN

4、A修飾電極可以有效地分離多巴胺與電活性干擾組分抗壞血酸和尿酸的電化學氧化峰?；陔姵练eDNA修飾電極這種選擇性電催化氧化多巴胺分子的性質，發展了一種簡單、快速、高靈敏度和高選擇性的多巴胺電化學檢測方法，有效地拓展了核酸修飾電極的應用范圍。
　　 (2)基于T-Hg(Ⅱ)-T絡合與酶催化信號放大的電化學汞離子傳感器酶催化信號放大是生物傳感器系統中常用的一種高靈敏度信號轉換手段，現已廣泛應用于免疫傳感和核酸分析。第3章的研究工作將酶

5、催化信號放大引入基于汞離子特異核酸修飾電極的電化學傳感體系中，根據堿基互補配對原則和T-Hg(Ⅱ)-T絡合原理設計了兩條汞離子特異的核酸探針，包括巰基固定基團標記的捕獲核酸探針和生物素分子標記的信號核酸探針。利用T-Hg(Ⅱ)-T絡合調節的核酸探針雜交和生物素-親核素結合系統將鏈酶親和素標記的辣根過氧化酶(streptavidin-horseradish peroxidase，S-HRP)固定于電極表面，固定化的S-HRP催化過氧化氫將

6、對苯酚氧化為對苯醌，氧化性的酶催化產物對苯醌進一步在基底電極表面被電化學還原，提供用于Hg2+定量分析的放大電流信號。該酶催化信號放大電化學傳感器對汞離子的檢測表現出很高的靈敏度和選擇性，汞離子濃度檢測線性范圍為0.5 nM～1μM，檢測限可低至0.3 nM。
　　 (3)基于鳥嘌呤四股螺旋-血紅素絡合物電化學催化信號放大的汞離子傳感器分子內包含重復鳥嘌呤堿基(guanine，G)單元的核酸鏈可與血紅素分子(hemin)形成具有

7、類似于辣根過氧化酶催化活性的鳥嘌呤四股螺旋-血紅素絡合物(G4-Hemin)。在第4章，研究了通過核酸雜交固定于金電極表面的G4-Hemin絡合物的電化學性質，發現G4-Hemin絡合物在金電極表面表現出直接的電化學行為，并且可以顯著催化過氧化氫的電化學還原?；贕4-Hemin絡合物的電化學催化性質，設計了一條同時包含Hg2+特異堿基序列和G4序列的信號核酸探針，該信號核酸探針可以選擇性識別Hg2+，同時可結合Hemin形成電化學催化

8、信號標記?；谠撔滦秃怂崽结?，成功地構建了一個無需共價修飾信號標記、電化學催化信號放大的高靈敏度和高選擇性電化學汞離子傳感器。
　　 (4)基于分子識別調節碳納米管隧道電流效應的電化學傳感平臺經由疏水作用吸附于烷基硫醇自組裝層上的碳納米管可以恢復電活性探針鐵氰化鉀被烷基硫醇絕緣單分子層抑制的氧化還原電流，表現出碳納米管的“隧道電流效應”；單鏈核酸可通過分子內堿基與碳納米管管壁間的π-π共軛作用穩定地結合于碳納米管表面。第5章的研

9、究工作發現烷基硫醇自組裝層上碳納米管吸附層的“隧道電流效應”可通過碳納米管表面結合的單鏈核酸探針與目標分子間的識別反應進行靈活的調節，即核酸探針與目標分子之間的結合可調控鐵氰化鉀在碳納米管吸附層上的隧道電流響應。利用這一獨特的性質，開發了一種基于新的核酸探針固定方法和信號轉換方法的電化學傳感系統，并實現了重金屬離子銀離子的高靈敏度和高選擇性電化學檢測。
　　 (5)基于發夾探針與酶催化信號放大的核酸掃描電化學顯微鏡研究第6章的研

10、究工作針對傳統三電極DNA電化學傳感體系中工作電極(即DNA修飾電極)表面電化學惰性常常造成電化學響應信號靈敏度損失的缺點，嘗試將四電極體系的掃描電化學顯微鏡(scanning electrochemical microscopy，SECM)引入DNA電化學傳感器的設計與制備。在該SECM核酸傳感體系中，末端分別標記巰基基團和生物素分子的發夾DNA探針通過自組裝的方法固定于金電極表面，目標DNA與發夾探針的雜交導致發夾探針末端的生物素分

11、子暴露于電極表面，進一步通過生物素-親和素結合系統將鏈酶親和素標記的辣根過氧化酶(streptavidin-horseradish peroxidase，S-HRP)固定，電極表面固定化的S-HRP催化過氧化氫氧化對苯二酚生成大量電化學氧化活性的對苯醌，然后采用SECM的“基底產生-探針收集”工作模式監測酶催化產物對苯醌的還原電流并以此實現對目標DNA的定量分析和電化學掃描成像。該SECM傳感體系對目標DNA的檢測限可低至17 pM，并