ELISA-CDC技術在腎移植中的應用研究.pdf

1、研究背景:目前臨床上開展的組織器官移植中絕大多數屬于無血緣關系供受體之間的同種異體移植。由于人類HLA系統為高度多態性,在人群中難以找到與受體HLA完全相同的供者,因此同種異體器官移植都有可能發生排斥反應。為了減少排斥反應、提高移植成功率、延長移植物有功能存活,移植前嚴格進行組織配型,對供受者進行免疫學選配就非常重要。移植供受體選擇的免疫學因素包括:①ABO血型相容原則；②HLA配型；③交叉細胞毒試驗；④群體反應性抗體檢測。
　　

2、 人類白細胞抗原(human leukocyte antigens,HLA)被稱為移植基因,HLA組織配型包括:①HLA抗原分型；②HLA抗體分析,即對群體反應性HLA抗體的識別(panel reaction antibody,PRA)和抗供者特異性HLA抗體的分析(complement-dependent cytotoxicity,CDC)。檢測受者血清中HLA抗體特異性(PRA)用以識別受者不能接受的HLA抗原,檢測受者血清中特異

3、性抗供者HLA的抗體(CDC)用以識別受者可以接受的HLA抗原。CDC是腎移植術前、術后主要的組織相容性實驗之一,是移植前供受體選擇的最重要的免疫學實驗,對預防超急性及加速性排斥反應、監測受者免疫狀態、減少免疫抑制劑毒副作用及提高移植腎及移植受者近遠期有功能存活率有重要意義,CDC陽性被認為是移植的絕對禁忌癥。移植前受者體內如果存在抗供者特異性抗體(donor specificanti-HLA antibodies,DSA),抗體介導的

4、排斥反應(AMR)極有可能導致移植腎的早期失功。病人的循環抗體水平會隨血液透析頻率、效果而波動變化以及/或病人接受了輸血或其它形式(再次移植、妊娠)的致敏,即使用病人當前血清進行移植前交叉配型為陰性,但由于病人存在記憶性免疫應答,仍會引起超急性排斥和(或)早期移植腎失功,因此有必要對移植術后受者血清進行連續監測。目前用于CDC的方法主要包括補體依賴淋巴細胞毒交叉配型方法(NIH-CDC)和流式細胞交叉配型方法(FCXM),CDC結果為陽

5、性時也可能獲得較好的移植腎/受者近遠期有功能存活率；相反地,CDC結果為陰性時,移植腎也可能發生早期失功。NIH-CDC和FCXM的實驗結果與移植后效果常不相符,其可靠性欠佳,ELISA-PRA能更準確地反映受者體內的致敏情況,PRA強度與移植腎存活率有關,但ELISA-PRA檢測出的抗體不一定是針對供者的特異性抗體。目前研究表明ELISA法比CDC法在檢測HLA抗體中有較強的敏感性和特異性,ELISA法具有測定結果客觀,重復性好；只能

6、檢測特異性抗HLA-IgG抗體,不受其他抗體的干擾;既可測定補體結合的HLA抗體,也可測定非補體結合的HLA抗體；不需要活的淋巴細胞,大大方便了臨床應用等優勢,被認為是目前HLA抗體篩選技術的“金標準”。目前國內外許多器官移植中心傾向于在移植術前分別采用兩種交叉配型方法檢測,以提高對DSA的識別能力,預防嚴重排斥反應的發生,常用的組合包括NIH-CDC+AHG-CDC或NIH-CDC+FCXM等,因此建立一種新的交叉配型方法也方便臨床上

7、根據需要選擇。因此可以考慮依據ELISA原理建立一種新的CDC實驗方法,以更好地預測排斥反應。
　　 目的:為了提高對DSA識別的敏感性和特異性,為移植術前、術后提供一種DSA的監測方法,更好地預測排斥反應,本研究利用國內各器官移植實驗室已有的組織配型實驗條件,不需增加特殊實驗設備,創新性建立ELISA-CDC實驗技術,對已知HLA抗體特異性的PRA陽性血清進行ELISA-CDC實驗,以比較ELISA-CDC與ELISA-PRA

8、在同一特異性HLA抗體識別上的吻合率,探討其在移植前供受者交叉配型及移植術后監測DSA中的應用價值,并對2010年1月～2010年12月間接受同種異體腎臟移植受者以NIH-CDC陰性為移植入選標準,當NIH-CDC為陰性時,若ELISA-CDC陽性則排除患者接受此器官,密切觀察受者移植術后的病情變化,注意有無超急性排斥反應或加速性排斥反應的發生。
　　 方法
　　 1.研究對象
　　 1.1.實驗方法的建

9、　　 (1)供者淋巴細胞的提取和淋巴細胞裂解物的制備；
　　 (2)實驗質控系統的建立:試劑質控、溶解質控和陰性質控,用酶標儀讀取吸光度A值,通過對比陰性對照的OD值來確定陽性標本和陰性標本；
　　 (3)依據ELISA原理,特異性檢測。
　　 1.2.實驗方法的驗證
　　 1.2.1.標本的采集所有標本選自5例已知HLA基因的淋巴細胞和24例已知HLA抗體特異性的ELISA-PRA陽性血清。24例已知

10、HLA抗體的PRA陽性血清分為95份分別和針對性HLA-A、B、DR基因的淋巴細胞為第一組,其中與相應針對性HLA-A、B基因淋巴細胞的為51份,與針對性HLA-DR基因的淋巴細胞的為44份；24份已知HLA抗體的血清和無針對性HLA-A、B、DR基因的淋巴細胞為第二組,其中與無相應針對性HLA-A、B基因的淋巴細胞的為13份,與無針對性HLA-DR基因的淋巴細胞的為11份；35份PRA-Ⅰ類或Ⅱ類陰性血清為陰性對照組,其中PRA-Ⅰ類

11、陰性的為20份,PRA-Ⅱ類陰性的為15份。
　　 1.2.2.統計結果的處理采用SPSS13.0統計軟件數據包對所有數據進行記錄分析,兩種檢測方法之間采用配對x2驗(McNemar)。兩種檢測方法之間吻合度行Kappa檢驗。P≤0.05判斷為差異具有統計學意義。
　　 1.3.臨床移植受者的觀察和統計
　　 1.3.1.臨床移植受者的觀察對2010年1月～2010年12月間接受同種異體腎臟移植受者以NIH-CD

12、C陰性為移植入選標準,當NIH-CDC為陰性時,若ELISA-CDC陽性則排除患者接受此器官。密切觀察受者移植術后的病情變化,注意有無超急性排斥反應或加速性排斥反應的發生。
　　 1.3.2.統計結果的處理采用SPSS13.0統計軟件數據包對所有數據進行記錄分析,PRA陽性組和陰性組之間采用兩個獨立樣本率比較的x2檢驗。P≤0.05判斷為差異具有統計學意義。
　　 2.實驗方法
　　 2.1.捕獲抗原:用淋巴細胞

13、分離液從供者靜脈血中分離出淋巴細胞,再用淋巴細胞裂解液裂解,分裝后立即使用或放入-80℃溫度下保存。
　　 2.2.ELISA實驗:從4℃冰箱中取出所有試劑,平衡至室溫,取出板條,記錄紙上標記陰性對照、裂解物對照、陽性對照及空白孔的位置。測Ⅰ類抗體的裂解液用裂解和耦聯稀釋液(LCD)8倍稀釋,測Ⅱ類的用LCD4倍稀釋,干淋巴細胞對照裂解物用LCD4倍稀釋。除指定作為陽性對照孔和空白對照孔外,其余各孔均加入已稀釋的供者淋巴細胞裂解

14、物15ul,陽性對照孔中加入“對照細胞裂解物”,空白孔不加任何試劑,37℃溫箱孵育30min,取出甩干,洗板4次。用標本稀釋液(SD)1:3稀釋受者血清和陰、陽性對照,相應孔內加入已稀釋血清15ul,裂解物對照孔中加入15ul LCD,37℃溫箱孵育30min,取出甩干,洗板4次。用SD1:100稀釋Anti-IgG抗體,用LCD1:100稀釋裂解對照試劑LCR1和LCR2,除空白和裂解物對照孔外,每孔各加15ul已稀釋的Anti-Ig

15、G抗體,Ⅰ類和Ⅱ類裂解物對照孔分別加入已稀釋的LCR1、LCR2各15ul,置37℃溫箱孵育30分鐘,取出甩干,洗板4次。用0.5ml去離子水溶解對硝基苯磷酸(PNPP)粉末,每一條加0.5ml酶底物溶液和5ul PNPP溶液,除空白孔外,每孔加已稀釋的酶底物溶液50ul,22-25℃避光反應30min,各孔加入50ul終止液,空白對照孔加100ul終止液。30min內在波長為405nm的酶標儀上讀取吸光度A值。
　　 2.3.

16、結果判斷與分析:通過對比陰性對照的OD值來鑒定陽性及陰性標本。根據在波長為405nm的酶標儀上讀取吸光度A值,樣本檢測值≥2倍陰性對照值,則判為陽性；樣本檢測值<2倍陰性對照值,則判為陰性。
　　 結果
　　 1.實驗方法的建立
　　 (1)淋巴細胞的裂解產物可以置于-80℃冷凍保存,以供2年內使用,可作回顧性淋巴細胞毒交叉配型實驗和移植術后免疫學監測；
　　 (2)實驗時間:平均每次ELISA-CDC需

17、時2.5～3h；
　　 (3)實驗的整套檢測系統包括3套質控:試劑質控、溶解質控和陰性質控,用酶標儀讀取吸光度A值,結果穩定客觀；
　　 (4)測定結果:ELISA測定顯示裂解物對照孔A值>0.900,表明足量的HLA糖蛋白已被捕獲；試劑對照孔A值>1.000,說明試劑系統工作正常；陰性對照孔A值<0.300；
　　 (5)從供者的淋巴細胞裂解物中提取HLA-Ⅰ類和Ⅱ類抗原,并借助特異性單克隆抗體將其固化在ELI

18、SA板上,與受者血清進行酶聯免疫吸附反應,特異性檢測HLA-IgG抗體,IgM、IgA抗體和非特異性抗供者HLA-IgG抗體會因不結合而被洗掉,排除了非HLA抗體、非IgG類抗體和非供者特異性抗體的影響；
　　 (6)ELISA-CDC使用的是供者淋巴細胞的裂解產物,不受淋巴細胞活力影響；
　　 (7)一種裂解產物能分別檢測出特異性的HLA-Ⅰ、Ⅱ類抗體,在強Ⅰ類抗體存在時能檢測到Ⅱ類抗體；
　　 (8)既能檢測

19、補體結合抗體,也能檢測非補體結合抗體。
　　 2.實驗方法的驗證:選自ELISA-PRA陽性血清,24例已知HLA抗體的血清分為95份分別和針對性HLA-A、B、DR基因的淋巴細胞ELISA-CDC實驗為第一組,其中與針對性HLA-A、B基因的淋巴細胞的為51份,與針對性HLA-DR基因的淋巴細胞的為44份,實驗結果均為陽性；24份已知HLA抗體的PRA陽性血清和無針對性HLA-A、B、DR.基因的淋巴細胞ELISA-CDC實驗

20、為第二組,其中與無針對性HLA-A、B基因的淋巴細胞的為13份,與無針對性HLA-DR基因的淋巴細胞的為11份,實驗結果均為陰性；35份PRA-Ⅰ類或Ⅱ類陰性血清與上述2組淋巴細胞ELISA-CDC實驗為陰性對照組,其中PRA-Ⅰ類陰性的為20份,PRA-Ⅱ類陰性的為15份,實驗結果亦為陰性。ELISA-CDC與ELISA-PRA對同一特異性HLA抗體的識別采用配對x2檢驗(McNemar),P=1.000,表明ELISA-CDC與EL

21、ISA-PRA對同一特異性HLA抗體的識別的差異無統計學意義。兩種檢測方法之間的吻合度行Kappa檢驗,Kappa=1.000,P<0.001,表明兩種方法的吻合度有統計學意義,且吻合度極強。
　　 3.臨床移植受者的觀察:以NIH-CDC陰性為腎臟移植入選標準,當NIH-CDC為陰性時,若ELISA-CDC陽性則排除患者接受此器官。期間共有101例受者接受了同種異體腎臟移植,其中男性74例,女性27例；PRA陰性85例,PRA

22、陽性16例。密切觀察移植受者術后的病情變化,PRA陰性受者和PRA陽性受者移植術后均未發生超急性排斥反應或加速性排斥反應。PRA陽性組和陰性組之間采用兩個獨立樣本率比較的x2檢驗,P=1.000,表明PRA陽性組和陰性組之間發生排斥反應的差異無統計學意義。
　　 結論:目前用于CDC的方法的實驗結果與移植后效果常不相符,其可靠性欠佳,ELISA-PRA能更準確地反映受者體內的致敏情況。ELISA-CDC和ELISA-PRA均是依

23、據ELISA原理,排除了非HLA抗體和非IgG類抗體的影響。ELISA.CDC能夠表達出與ELISA-PRA一致的HLA抗體特異性。在方法學上,ELISA-CDC具有比NIH-CDC敏感性高,比FCXM準確性高的優勢。雖然PRA強度與移植腎存活率有關,但ELISA-PRA檢測出的抗體不一定是針對供者的特異性抗體,ELISA-CDC是從供者的淋巴細胞裂解產物中提取HLA抗原,排除了非供者特異性抗體的影響。
　　 ELISA-CDC

24、較目前用于CDC的實驗方法還具有如下優勢:ELISA-CDC使用的是供者淋巴細胞的裂解產物,不受細胞活力影響；ELISA-CDC結果穩定而客觀,有可能實現檢測過程的自動化；一種裂解產物能分別檢測出特異性的Ⅰ、Ⅱ類抗體,在強Ⅰ類抗體存在時能檢測到Ⅱ類HLA抗體；治療性免疫抑制劑不會影響結果；ELISA-CDC可以提純供者HLA抗原低溫長期保存,不僅便于移植前多個受者與單一供者交叉配型,而且便于移植術后使用同一供者HLA基因進行監測DSA。

25、
　　 ELISA-CDC可能比較準確地反應了受者體內的致敏狀態,當NIH-CDC為陰性時根據ELISA-CDC陽性排除此病人接受此器官移植,可有效地降低超急性和加速性排斥反應的發生率,為移植受者特別是PRA陽性受者尋找合適的供體提供了一種較為可靠的交叉配型方法。此外,ELISA-CDC操作簡單易行,耗時也不長。當HLA特異性不確定或者目前CDC方法的陽性結果需要進一步證實時,ELISA-CDC的結果也可以做為重要的參考依據。E

26、LISA-CDC在移植前供受者交叉配型及移植術后監測DSA中均具有一定的優勢,在臨床上有推廣價值。
　　 本研究中ELISA-CDC實驗結果與ELISA-PRA完全吻合,可能與樣本量不足有關,所以進一步的研究可以考慮加大樣本量。本研究僅進行了ELISA-CDC與ELISA-PRA的吻合率比較,及觀察術前ELISA-CDC陰性受者術后有無超急性排斥反應或加速性排斥反應的發生,暫時未將ELISA-CDC方法應用于移植術后的監測,觀察