厭氧氨氧化微生物學研究.pdf

1、針對厭氧氨氧化菌分離困難這一現狀，本課題循著“獲得厭氧氨氧化菌混培物，研究混培物性狀；獲得厭氧氨氧化菌純培物，研究純培物性狀”的技術路線，對厭氧氨氧化的微生物學性能進行了系統的研究，結果總結如下：
　　 1)以垃圾填埋場滲濾液處理廠污泥(W1)、城市污水處理廠污泥(W2)以及味精廢水處理廠污泥(W3)作為接種物，以經處理的味精廢水作為培養液，經過400多天的富集，都獲得了顯現厭氧氨氧化活性的富集培養物，表明三種污泥都可作為厭氧氨

2、氧化反應器的接種污泥。
　　 以表觀最大厭氧氨氧化速率(Vmax)作為指標，W3富集培養物的厭氧氨氧化活性(5.26 mg/L.h)最高，W1富集培養物(4.20 mg/L.h)次之，W2富集培養物(2.83 mg/L.h)最低。以污泥顆粒的大小，菌膠團的結構，污泥的沉降速度以及污泥體積指數作為指標，W3污泥最佳，W2污泥次之，W1污泥最差。以VS/TS作為指標，富集前后W1污泥的質量基本保持不變；W2污泥和W3污泥的質量都明顯

3、提高，其中W3污泥的質量提高最多，W2污泥次之，W1污泥最少。從三種接種污泥均可成功定向富集厭氧氨氧化菌，其中以W3污泥富集的厭氧氨氧化菌數量最多，W1污泥和W2污泥的厭氧氨氧化菌數量比較接近。富集以后，三種污泥的種群數量減少，但在DGGE膠上都出現了厭氧氨氧化菌的特異性條帶，其中以W3污泥的條帶最亮，W2污泥次之，W1污泥最弱，表明富集以后W3污泥的厭氧氨氧化菌豐度最高，W2次之，W1最小。
　　 2)以硝化污泥作為接種污泥，

4、用顆粒污泥床反應器、固定床生物膜反應器和厭氧序批式反應器富集厭氧氨氧化菌，都可成功積累厭氧氨氧化菌混培物，完成厭氧氨氧化啟動。其中，厭氧氨氧化序批式生物反應器積累厭氧氨氧化混培物最快，啟動時間最短(約30 d)，容積總氮去除負荷最高(約2047.00 mq/L.d)；固定床生物膜反應器積累混培物的速度次之，啟動時間約40 d，容積總氮去除負荷為2027.27 mg/L.d；顆粒污泥床反應器積累混培物的速度最慢，啟動時間最長(約60 d)

5、，容積總氮去除負荷最低(約1986.9 mq/L.d)。
　　 三種反應器的運行穩定性存在一定差異。厭氧序批式反應器對基質濃度持續變化的耐受能力最弱，生物膜反應器次之，顆粒污泥床反應器最強。反之，厭氧序批式反應器對水力停留時間持續變化的耐受能力最強，生物膜反應器次之，顆粒污泥床反應器最弱。在三個反應器中，顆粒污泥床對基質負荷持續變化的敏感性低于水力負荷持續變化，操作中應注意控制進水流量；生物膜反應器和厭氧序批式反應器能耐受水力負

6、荷的持續變化，但對濃度負荷持續變化較為敏感，操作中應注意控制進水濃度。
　　 對于顆粒污泥床反應器和生物膜反應器，當進水氨濃度上升至336 mg/L以后，出水NO3--N濃度呈下降趨勢，而對于序批式反應器，出水NO3--N濃度波動不大，并保持在較高水平，若以硝酸鹽產量估算厭氧氨氧化菌產量，則表明在進水氨氮濃度較高的情況下，序批式反應器比污泥床反應器和生物膜反應器更有利于厭氧氨氧化菌的生長和菌體積累。
　　 3)將硝化污泥

7、接種于厭氧序批式反應器中，經歷延滯階段、生長階段和穩定階段，可形成厭氧氨氧化顆粒污泥。在污泥顆?；^程中，污泥外觀發生明顯變化，污泥表面孔隙增加，密實度下降，顏色從土黃色變成鮮艷的橙紅色。污泥理化性狀也有明顯改變：污泥顆粒明顯增大，平均粒徑從1.20 mm增加到3.69mm，平均濕密度從1.04 g/mL增加到1.07 g/mL，平均沉降速度從107.68 m/h增加到118.49 m/h。顆粒污泥的形成使污泥抗水力沖擊的能力明顯增強，

8、隨出水流失的污泥量較少(TSS<0.03 g/L)，表明厭氧氨氧化顆粒污泥的形成使反應器內持留高濃度污泥成為可能。
　　 在厭氧氨氧化污泥顆?；^程中，污泥的微生物組成從以絲狀菌和球菌為主轉變成以不規則形狀的厭氧氨氧化菌為主。三大菌群計數結合PCR-DGGE試驗證實，在污泥顆?；^程中厭氧氨氧化菌得到有效富集，反應器內總氮去除活性增加51.7倍。
　　 研究了營養因子和理化因素對厭氧氨氧化污泥顆?；挠绊?。獲得的厭氧氨氧

9、化顆粒污泥的最大氨氧化速率為6.08 mg/L.h，最大亞硝酸鹽轉化速率為6.32mg/L.h。厭氧氨氧化菌混培物利用氨的Km值為130.63 mg/L，利用亞硝酸鹽的Km值為51.30 mg/L。氨自身的抑制常數為478.69 mg/L，實際取得最大厭氧氨氧化速率的氨濃度為109.50 mg/L。亞硝酸鹽對厭氧氨氧化的抑制常數為345.44mg/L。厭氧氨氧化的最適pH為7.61，最適溫度為30℃。
　　 4)采用系統稀釋和平

10、板劃線分離的方法，獲得了7株具有亞硝化活性的菌株，其中一株是放線菌，經鑒定歸于鏈霉菌屬的比基尼鏈霉菌，因時間關系未試驗該菌的厭氧氨氧化活性。選取N1菌株作為研究對象，研究了厭氧氨氧化活性。N1菌株有鞭毛，能夠運動；菌體呈橢球形，大小為0.8～1.2×1.0～1.5μm；菌落呈白色，圓形，直徑較小(1 mm左右)。革蘭氏染色反應為陰性。N1菌株的內膜折疊成平囊狀，有規則地分布于細胞質外圍，屬于典型的Nitrosomonas屬內膜特征。從形

11、態、大小和內膜排列、G+C％含量、16S rDNA序列測定和系統發育分析表明，N1菌株屬于Nitrosomonas halophila。
　　 N1菌株是典型的亞硝化細菌，在好氧下該菌株的最大氨氧化速率為9.83mg/L.d，最適pH為8.47。在厭氧下該菌株具有厭氧氨氧化活性，最大厭氧氨氧化速率是0.77 mg/L.d，氨和亞硝酸鹽以1:1.21的比例轉化，但不能生長。
　　 5)從厭氧氨氧化富集培養物中分離獲得了3株

12、具有厭氧氨氧化活性的反硝化菌，編號為D1，D2和D3，以D3菌株的厭氧氨氧化活性最強。
　　 D3菌株為桿菌，0.4～0.6×1.4～1.8μm，單極生鞭毛。菌落乳白色，圓形，菌落油滴狀，直徑2-3 mm。革蘭氏染色反應為陰性。D3菌株的形態觀察結果、生理生化試驗結果、BitekGN系統測試結果、Biolog碳源利用微平板鑒定系統的鑒定結果、菌株G+C mol％含量測定結果和系統發育分析結果，一致將D3菌株歸入假單胞菌屬，門多薩

13、假單胞菌(Pseudomonas mendocina)。
　　 在普通細胞培養基上生長時D3菌株的比生長速率為0.342/h，代時為2.03h，最適生長pH為8.11，最適生長溫度為34.5℃；在反硝化培養基上生長時D3菌株的比生長速率為0.148/h，代時為4.69 h，最適生長pH為7.81，最適生長溫度為34.5℃。D3菌株具有明顯的反硝化活性，最大硝酸鹽還原速率為14.96mg/L.d。D3菌株具有明顯的厭氧氨氧化活性，

14、在厭氧下同時消耗氨氮和硝酸鹽，消耗的比值為1:1.91。
　　 研究了D3菌株細胞結構與厭氧氨氧化活性的關系，發現該結構與厭氧氨氧化活性密切相關，隨厭氧氨氧化活性的出現而出現，隨厭氧氨氧化活性的消失而消失。
　　 6)采用逐級稀釋和滾管法分離獲得了4株具有厭氧氨氧化活性的菌株，編號為P1，P2，P3和P4，選取厭氧氨氧化活性最強的P2菌株進行了進一步的研究。
　　 P2菌株形態不規則，滾管上生長的菌落呈圓形，直徑