食品中羅丹明B的殘留免疫檢測方法的研究.pdf

1、羅丹明B（RB）是一種人工合成的具有鮮桃紅色的三苯甲烷類堿性的染料，我國和歐盟等都不允許在食品中添加。本論文旨在建立羅丹明B的免疫檢測方法。根據羅丹明B的結構，用混合酸酐法與牛血清白蛋白（BSA）偶聯，用碳二亞胺法與卵清白蛋白（OVA）偶聯，制備出免疫原RB-BSA，包被原RB-OVA。通過紫外/可見分光光度計對合成的人工抗原進行鑒定，偶聯物具備半抗原和蛋白的雙重特征吸收峰，因此可以判斷偶聯成功?？捡R斯亮藍法測得免疫原的蛋白濃度，計算其

2、偶聯率，偶聯率為11.67。利用免疫原RB-BSA免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，采用間接ELISA測定效價、抑制率篩選出特異性好的多克隆抗體。所得的抗血清效價為64000。依此抗血清為基礎，初步建立間接競爭ELISA方法，并通過對包被緩沖液、封閉液、抗體稀釋液、樣品稀釋液（pH、甲醇、NaCl）等條件的優化以獲得更好的結果。最終得到最佳的工作條件即包被液為pH=9.6的碳酸鹽緩沖液，封閉液為含0.1％明膠的包被緩沖液，一抗稀釋液為含0

3、.1％明膠、0.05％Tween-20的磷酸緩沖液，二抗稀釋液為含5％海藻糖、0.5％BSA、0.05％Tween-20的磷酸緩沖液，標準品稀釋液為添加3.6％ NaCl的pH7.4的PBS。
　　 優化后最終的到羅丹明B標準曲線。檢測限0.1ng/mL，半數抑制量（IC50）為1ng/mL，線性范圍為0.1～20ng/mL。包被原濃度為2μg/mL，抗體工作濃度3μg/mL，該抗體具有較強的特異性，與羅丹明 6G、結晶紫、赤蘚

4、紅、孔雀石綠進行交叉反應，交叉反應率均小于0.1％。羅丹明B在辣椒粉樣品添加回收率為67.87-89.30％，變異系數小于15％，達到對羅丹明B殘留快速檢測的要求。
　　 用羅丹明B抗體建立免疫親和柱(IAC)樣品凈化方法，并利用高效液相-質譜聯用（HPLC-MS）檢測。對實際樣品進行添加實驗，回收率為65.4-95.30％。其檢測效果與ELISA方法相符，由此可見羅丹明B的ELISA及IAC-LC/MS的檢測方法是羅丹明B食品