富硒及高谷胱甘肽酵母菌選育的研究.pdf

1、本文對高生物量富硒酵母的菌種選育和培養條件初步優化進行了研究;并對γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH-I進行了克隆,在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達,有效提高了釀酒酵母的谷胱甘肽(GSH)生成量.從300株工業生產用酵母中,篩選出對亞硒酸鈉抗性較高的菌株.再從中選出生物量較高的二倍體菌株S.cerevisiae ZY-67和細胞硒含量較高的二倍體菌株Saccharomyces kluyveri ZY-

2、198,對其進行生孢子培養和單倍體分離.用亞硝基胍(NTG)對生物量較高的單倍體ZY-67-18(α)和細胞硒含量較高的單倍體ZY-198-21(α)進行誘變,從突變株中選出生物量較高的ZY-67-18-34(α,leu<'->)和硒含量較高的ZY-198-21-6(α,trp<'->)作為融合親株.通過原生質體融合,選育具有雙親的優良性狀,且遺傳性狀穩定的融合子ZFF-28,其硒總含量分別是原始親株ZY-67和ZY-198的2.8倍和

3、2.0倍.通過單因素實驗和正交試驗設計L<,16>(4<'3>×2<'6>),確定了融合子ZFF-28的優化培養條件.在優化培養條件下,菌株ZFF-28的生物量可達8.2g/L,硒含量達2050μg/g,硒總含量達到了16810μg/L,是培養條件優化前的1.3倍,且細胞硒含量的91﹪為有機硒.以GSH含量相對高的1<'＃>釀酒酵母的DNA為模板,通過PCR擴增出4.2kb的目的基因GSH-I片段.將目的基因片段插入穿梭質粒YEp352

4、的多克隆位點,構建重組質粒pGF-2.pGF-2轉化單倍體釀酒酵母YS58,轉化子的GSH含量是受體菌的1.7倍,且轉化子的生物量沒有因為質粒pGF-2的轉入而受到影響.將0.43kb的CUPI啟動子片段,0.9kb的金屬硫蛋白基因MTI片段,GSH-I基因片段,BamHI/SalI雙酶切的YEp352片段,用T<,4>連接酶連接,構建重組質粒pGMF.用重組質粒pGMF轉化青島啤酒酵母S.cerevisiae YSF-31,以銅抗性(