2型糖尿病相關基因的研究.pdf

1、目的：糖尿病(diabetes mellitus，DM)和肥胖(obesity，0B)均是由遺傳因素和環境因素相互作用而引起的代謝異常性疾病。大量的研究結果表明，基因的多態性與肥胖和糖尿病的發生有著密切的關系，基因的多態性是肥胖和糖尿病發生的重要遺傳因素。 線粒體內含有DNA，還含有自身的蛋白質合成系統，是核外的另一遺傳基因攜帶體。細胞核基因遺傳和線粒體基因遺傳雖各自相對獨立，但二者之間也存在相互依存，相互影響。 目前

2、，核基因組(nDNA)和線粒體基因組(mtDNA)基因變異導致糖尿病發生的研究均取得了一定的進展，而對于肥胖的發生，學者們的關注點仍停留在肥胖與生活方式與飲食結構的關系上，肥胖易感基因的研究只限于核基因的篩查，尚未涉及到線粒體基因。 核基因Foxa2 (Forkhead boxa2)是翼螺旋轉錄因子家族的一個成員，Foxa2是肝臟重要代謝基因的轉錄激活因子，其活性可以被胰島素抑制。有研究證實，空腹狀態下，低胰島素水平可激活Fox

3、01和Foxa2，Foxol的激活可導致葡萄糖異生增加，Foxa2的激活則導致脂肪酸β氧化及酮體形成增加和極低密度脂蛋白合成增多。在胰島素抵抗狀態下，減弱的胰島素信號不能抑制Foxol但能抑制Foxa2的活性，導致葡萄糖異生增加，脂肪酸β氧化減少和極低密度脂蛋白合成減少，這些改變可導致2型糖尿病的發生。 近年來，線粒體基因突變導致糖尿病發生的研究也取得了很大的進展，約有10余種線粒體基因突變被發現與糖尿病發生有關。迄今為止，國

4、內外還沒有關于線粒體基因突變導致肥胖發生的相關性研究的報道。但是，線粒體的氧化磷酸化過程與人體的能量代謝密切相關，而且線粒體呼吸鏈中多肽功能的異?；蛄康臏p少，可干擾三羧酸循環的順利進行，因此線粒體的異常也可能對肥胖的形成有一定的影響。 因此，在核基因組方面，本實驗通過對大連市2型糖尿病患者的外周血白細胞中的：foxa2基因的啟動子(promotor)和外顯子(exon)區域進行測序，篩查突變點(SNP)，并進一步觀察基因突變造成

5、的Foxa2基因功能異常與2型糖尿病之間的關系。在線粒體基因組方面，從Www．mitomap．org提供的眾多mtDNA SNP中選取了在日本2型糖尿病人群測序中發現的但在國內外未被報道的與2型糖尿病和肥胖有關聯的mtDNAA3537G、A4824G、A5351G、C6960T作為研究位點，研究線粒體DNA突變與肥胖和2型糖尿病的關系。 第一部分：foxa2基因突變與2型糖尿病相關性研究 研究對象和方法： 檢測

6、人群均來自大連市2型糖尿病患者，其中包括2005年1月至2006年2月大連地區2型糖尿病家系調查中收集到的患者61人(每家系中隨機選取1人)，國家95攻關糖尿病普查大連地區散發2型糖尿病患者56人以及大連市中心醫院內分泌科住院的糖尿病患者28人，共計145人，其中男性63人，女性82人。平均年齡56.56±13.62歲。非糖尿病者(NGT)均是普查中的健康人群，共334人，其中包括男性188人，女性146人，平均年齡52.31±10.5

7、9歲。健康人群入選標準為空腹血糖<5.6mmol/L，OGTT<7.8mmol/L，無其他內分泌疾病，無糖尿病家族史。確定樣本后，采集血樣，提取有核細胞基因組DNA，根據Foxa2序列設計引物，用多聚酶鏈反應技術(PCR)擴增含有foxa2基因啟動子和外顯子所在的基因片斷，對基因片斷進行測序，篩查突變點(SNP)。 結果：本實驗利用PCR技術對大連市2型糖尿病病人及健康人外周血白細胞DNA中Foxa2基因的編碼區域進行擴增，對擴

8、增片斷進行測序。與健康人群對照，在foxa2基因啟動子和外顯子所在的基因片斷上未發現SNP。 結論：在大連市2型糖尿病病人Foxa2基因啟動子和外顯子區域內未發現突變點，說明foxa2可能為高度保守性基因，大連2型糖尿病人群的糖尿病發病并非由Foxa2的基因突變所引起，而可能是由轉錄調節因子復合物中其他調節子的變異所致。 第二部分：線粒體DNA A3537G、A4824G、．A5351G、C6960T 4點多態性與肥胖及

9、2型糖尿病的相關性 研究對象及方法：研究對象均來自廣西公務員體檢人群中的超重和肥胖患者，共計496人，其中超重患者96人，男性60人，女性36人，平均年齡46.33±6.25歲；肥胖患者400人，其中男性280人，女性120人，平均年齡47.52±3.85歲。對照組為廣西地區體檢的健康對照人群137人，其中包括男性48人，女性89人，平均年齡45.47±5.50歲，BMI<23。確定樣本后，采集血樣，提取有核細胞基因組DNA，根

10、據線粒體DNA序列設計引物，用多聚酶鏈反應技術(PCR)擴增含有A3537G、A4824：G、A5351G、C6960T的所需片段，片斷長度分別為557bP、658bP、505bP，541bP，然后分別用AluI、BstEII、HhaI、Bg Ⅱ內切酶在37℃恒溫空氣循環箱中消化過夜，以8％聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳分離酶切產物，鑒別不同的基因型(AA、GG、CC、TT)。分別比較超重/肥胖組與對照組，同時對四個位點所構成的單倍型進

11、行分析。 結果： 1、廣西人群肥胖實驗分組標準應該采用2000年國際肥胖特別工作組提出的亞洲成年人BMI：分組標準。 2、在mtDNA A3537G．A4824G，A5351G，C6960T 4點多態性與肥胖的相關性研究中發現，只有A5351G點突變率在單純肥胖組與健康對照組的比較中有顯著的統計學差異：X<'2>=7.41，P=0.006，OR=3.53，95％CI=1.35～6.29。由于A5351G是同義突

12、變，因此提示A5357G突變點周圍可能存在與廣西體檢人群肥胖相關的連鎖不平衡風險基因突變位點，而與廣西體檢人群超重沒有相關性。 3、在mtDNA A3537G．A4824G，A5351G，C6960T 4點多態性與肥胖伴糖尿病的相關性研究中發現，4點突變率在0B+DM組和對照組間均無統計學差異，提示4點突變可能與廣西體檢肥胖患者中糖尿病的發生無相關性。 4、在mtDNA A3537G．A4824G，A5351G，C6

13、960T 4點多態性與肥胖伴糖耐量異常(IGT)的相關性研究中發現，只有A535 1G點突變率在0B+IGT組和對照組間存在統計學差異：X<'25>=8.296，P=0.004，OR=4.40，95％CI=1.49～9.63。由于A5351G是同義突變，因此提示，A5351G突變點周圍可能存在與廣西體檢肥胖患者中糖耐量異常發生相關連鎖不平衡風險基因突變位點。 5、在mtDNA A3537G．A4824G，A5351G，C696

14、0T 4點多態性與超重(OW)伴糖尿病/糖耐量異常的相關性研究中發現，4點突變率在OW+DM+IGT和對照組間均不存在統計學差異。提示，mtDNA A3537G．A4824G，A5351G，C6960T4點突變與超重組糖尿病/糖耐量異常無明顯相關性。 6、mtDNA A3537G．A4824G，A5351G，C6960T4：點共檢出5種單倍型，只有單倍型AAGC(G為5351點A突變成G)在病例一對照組的分布有顯著性差異(fre