生物鐘基因Bmall對腫瘤生長及抗癌藥物作用的影響及機制.pdf

1、研究背景與目的：
　　 漫長的生物進化過程中,為了適應自然界周而復始的周期變化,生物體從單細胞到高等動植物以及人類的所有生命活動均形成按照一定規律運行的、周期性的生命活動現象,即生物節律。研究發現生物鐘系統的存在,不僅產生和調節生物節律,以適應外界環境的影響和作用,它還是繼神經、體液和免疫系統之后又一機體重要的調控系統。大量的研究表明,生物節律紊亂會引起各種疾病的發生。生物節律與腫瘤的發生發展有著密切的聯系:生物節律的紊亂會導致

2、腫瘤的發生率增高,促進腫瘤的生長。
　　 生物鐘基因(Circadian clock gene)調控著機體的生物節律,它是由一組能夠通過自身的表達調控和形成正負反饋通路而產生生物節律的基因。目前已知的生物鐘基因有:Per(Per1、Per2、Per3)、Bmal1、Clock、Cry(Cry1、Cry2)、CKIε基因等。生物鐘基因不僅調控生物節律的變化,同時與維持機體內環境的穩定有關,從而可能影響腫瘤發生發展。
　　

3、本課題擬研究的Bmal1基因是哺乳動物生物鐘的核心組件,編碼蛋白質Bmal1,它與Clock同屬于bHLH-PAS結構域轉錄因子家族,在反饋回路中起正調控作用。Bmal1/Clock二聚體與E-box相結合,從而對Per、Cry、Rev—Erbα起正調控作用,維持著機體正常的生物節律。
　　 生物鐘基因與腫瘤之間的關系近年來也逐步受到重視。其中對Per1、Per2研究較多,而Bmal1開始受到關注。Mullenders等研究發現

4、在抑制Bmal1的表達的情況下,人成纖維細胞在受到γ射線照射后,p21蛋白表達下調,這是由于Bmal1沉默后p53激活其靶點p21的功能受到了抑制。但是另一項研究卻發現相反的情況,Bmal1基因敲除小鼠的正常肝細胞的p21基因呈失節律性的高表達。Matsuo等的研究顯示,在Clock基因突變小鼠,wee1的表達下調,并進一步證明Clock只有與Bmal1形成二聚體后才可以激活Wee1,進而可能影響細胞周期調控。Bmal1基因敲除小鼠和C

5、lock基因突變小鼠對抗癌藥物——環磷酰胺的毒副反應明顯增強,小鼠的體重均比對照組呈明顯下降。但有關Bmal1的研究尚較欠缺,而且不全面,現有的資料尚不能明確Bmal1在腫瘤發生發展過程中到底起何種作用；另外Bmal1的畸變或缺失對抗癌藥物作用產生何種影響,也值得深入探討。
　　 本課題試圖探討作為主要生物鐘基因的Bmal1在腫瘤生長中的作用,并研究其對抗癌藥物作用的影響及其機制。希望以此了解鐘基因,鐘控基因和鐘相關基因的調控及

6、與抗癌藥物治療的關系。
　　 方法與結果：
　　 1.沉默Bmal1基因的小鼠結腸癌C26細胞株的建立
　　 方法:構建靶向于Bmal1的RNAi質粒,慢病毒包裝,感染C26細胞,流式細胞儀分選陽性細胞,RT-PCR、Western blot檢測細胞Bmal1干擾效果。
　　 結果:RT-PCR結果發現的C26_Bmal1 shRNA細胞的Bmal1 mRNA水平明顯抑制,而只轉染慢病毒空載體C26_Co

7、ntrol shRNA細胞Bmal1的mRNA水平沒有改變。Western Blot結果也顯示C26_Bmall shRNA細胞的Bmal1蛋白水平明顯抑制,而C26_Control shRNA細胞的Bmal1蛋白水平沒有改變。
　　 2.沉默Bmal1對細胞生長的影響
　　 2.1沉默Bmal1在體外對細胞生長的影響
　　 方法:取對數生長期C26細胞、小鼠成纖維L929細胞以及小鼠原代小腸上皮細胞,繪制生長曲

8、線。
　　 結果:
　　 1)C26細胞生長明顯加快。在細胞生長96h時,C26 Control shRNA和C26_Bmal1 shRNA的OD值分別為0.78±0.16和1.18±0.03(均值±SD),Bmal1shRNA細胞較對照細胞生長加快51.28％(p<0.05)；在細胞生長120h時,上述兩株細胞的OD值分別為0.76±0.15和1.00±0.13,Bmal1 shRNA細胞較對照細胞生長加快28.39％

9、(p<0.05)。
　　 2)原代腸上皮細胞生長明顯加快。在細胞生長96h時,轉染Control siRNA和Bmal1 siRNA腸上皮細胞的OD值分別為1.36±0.23和1.60±0.32(均值±SD),Bmal1 siRNA細胞較對照細胞生長加快17.62％(p<0.05)；在細胞生長120h時,上述兩株細胞的OD值分別為0.83±0.12和1.10±0.15,Bmal1 siRNA細胞較對照細胞生長加快36.36％(p

10、<0.05)。
　　 3)L929細胞生長明顯加快。在細胞生長96h時,轉染Control siRNA和Bmal1siRNA的L929細胞的OD值分別為1.42±0.21和1.84±0.17(均值±SD),Bmal1siRNA細胞較對照細胞生長加快29.85％(p<0.05)。
　　 2.2沉默Bmal1在體內對細胞生長的影響
　　 方法:將相同數目(2×106)的C26_Control shRNA和C26_Bm

11、al1 shRNA種植到BALB/c小鼠腋下,待腫瘤長出后每3天測量腫瘤大小,繪制腫瘤生長曲線。接種腫瘤約30天后處死小鼠,取腫瘤,稱瘤重；取小鼠胸腺和脾臟,稱重。
　　 結果:比較兩組小鼠腫瘤的大小,發現C26_Bmal1 shRNA組小鼠較對照組生長明顯增快。腫瘤重量較對照組明顯增大,Control shRNA與Bmal1 shRNA組的瘤重分別為1.10±0.28和2.24±0.69克。接種Bmal1 shRNA細胞的小鼠

12、的胸腺指數較對照組明顯降低,有統計學差異(p<0.05)。
　　 3.沉默Bmal1對抗腫瘤藥物作用的影響
　　 方法:取對數生長期的C26_Control shRNA和C26_Bmal1 shRNA細胞,分別加入不同濃度的Docetaxel(DOC)和依托泊苷(VP-16),培養72h后,MTT法檢測細胞活性。
　　 結果:應用DOC和VP-16后,沉默Bmal1的細胞較對照組細胞的IC50分別明顯升高159.

13、3％和69.3％,有統計學差異(p<0.05)。
　　 4.沉默Bmal1對細胞凋亡的影響
　　 4.1沉默Bmal1對C26細胞凋亡的影響
　　 方法:取對數生長期的C26_Control shRNA和C26_Bmal1 shRNA細胞,應用PI/annexinⅤ雙染法檢測細胞凋亡。
　　 結果:對照組細胞凋亡率為3.1±0.2％,Bmal1沉默后細胞凋亡率為4.9±0.3％；應用可誘導細胞凋亡的抗癌藥

14、物VP-16,75μM和150μM作用24hr后,檢測細胞凋亡,結果發現C26_Control shRNA的凋亡率分別為24.6±7.5％、29.4±7.1％,而C26_Bmal1 shRNA的凋亡率分別為9.0±3.5％、11.2±5.3％,Bmal1沉默后細胞凋亡明顯減少,與對照組細胞C26_Control shRNA相比有統計學差異(p<0.05)。
　　 4.2沉默Bmal1對L929細胞凋亡的影響
　　 方法:

15、取對數生長期的L929細胞,利用脂質體介導siRNA轉染法沉默Bmal1基因,應用PI/annexinⅤ雙染法檢測細胞凋亡。
　　 結果:對照組和Bmal1沉默組的細胞凋亡率分別為15.9±1.8％、7.1±0.7％；應用可誘導細胞凋亡的抗癌藥物VP-16,75μM和150μM作用24hr后,檢測細胞凋亡,結果發現L929_Control siRNA的凋亡率分別為34.8±8.6％、39.9±7.2％,而L929_Bmal1 s

16、iRNA的凋亡率分別為11.3±3.3％、18.5±4.6％,Bmal1沉默后細胞凋亡明顯減少,有統計學差異(p<0.05)。
　　 5.沉默Bmal1對細胞周期的影響
　　 5.1沉默Bmal1對C26細胞周期的影響
　　 方法:取對數生長期的C26細胞,利用脂質體介導siRNA轉染法沉默Bmal1基因,應用PI染色法檢測細胞周期分布。在上述實驗的基礎上,我們應用細胞周期特異性藥物DOC,1μM、5μM作用于C

17、26_Bmal1 shRNA細胞與C26_ControlshRNA細胞48hr后,誘導細胞阻滯于G2/M期,應用Pl染色法檢測細胞周期分布。
　　 結果:siRNA轉染法沉默Bmal1的C26細胞與對照組相比在G2/M期的分布降低約28.2％。C26_Bmal1 shRNA細胞與C26_Control shRNA細胞相比,不用藥組、DOC1μM組與DOC5μM組分別下降39.3％、25.1％和11.7％,均有統計學差異(p<0.

18、05)。
　　 5.2沉默Bmal1對L929細胞周期的影響
　　 方法:取對數生長期的L929細胞,利用脂質體介導siRNA轉染法沉默Bmal1基因,應用細胞周期特異性藥物DOC,2.5μM、5μM作用48hr后,誘導細胞阻滯于G2/M期,應用PI染色法檢測細胞周期分布。
　　 結果:Bmal1沉默細胞與對照組細胞相比,不用藥組、DOC2.5μM組與DOC5μM組分別下降19.8％、7.6％和8.7％,均有統計

19、學差異(p<0.05)。
　　 6.沉默Bmal1基因對細胞DNA損傷修復的影響
　　 分別對C26細胞和L929細胞用順鉑處理24hr后,收集細胞,進行單細胞凝膠電泳,熒光顯微鏡觀察,拍照,計數。利用CometScore分析軟件分析實驗結果,統計DNA尾部百分含量(Tail DNA％,TD)和Olive尾矩(Olive tail momem,OTM)。
　　 實驗發現沉默Bmal1后,細胞的TD和OTM較對照組

20、明顯減少,顯示DNA損傷明顯減少。
　　 7.沉默Bmal1對生物鐘基因、細胞周期與凋亡調節基因表達的影響
　　 7.1沉默Bmal1基因對C26細胞生物鐘基因、細胞周期與凋亡調節基因表達的影響
　　 沉默Bmal1基因后,RT-PCR結果顯示,生物鐘基因per1、per2、per3基因表達下調,cry1表達上調,rev-erbα表達沒有明顯變化；細胞周期與凋亡調節基因wee1、p53、p21表達下調；c-myc

21、表達沒有明顯變化。
　　 7.2沉默Bmal1基因對小鼠原代腸上皮細胞生物鐘基因、細胞周期與凋亡調節基因表達的影響
　　 沉默Bmal1基因后,RT-PCR結果顯示,生物鐘基因per1、per2、per3基因表達下調,cry1、rev-erbα表達上調；細胞周期與凋亡調節基因wee1、p53表達下調；p21、c-myc表達上調。
　　 7.3沉默Bmal1基因對L929細胞生物鐘基因、細胞周期與凋亡調節基因表達的

22、影響
　　 沉默Bmal1基因后,RT-PCR結果顯示,生物鐘基因per1、per2、per3基因表達下調,cry1表達上調,rev-erbα表達沒有明顯變化；細胞周期與凋亡調節基因wee1、p53、p21表達下調；c-myc表達沒有明顯變化。
　　 8.沉默Bmal1對細胞周期調節蛋白表達的影響
　　 沉默Bmal1基因后,Western blot結果顯示,在C26細胞和L929細胞中,CDC2、cyclin

23、B1、cyclin D1、cyclinE的表達上調,而wee1、cyclinA表達沒有明顯變化。
　　 結論：
　　 (1)用RNAi法沉默生物鐘基因Bmal1后,在體外可以促進小鼠結腸癌細胞C26、小鼠成纖維細胞L929以及小鼠原代腸上皮細胞的增殖；在荷小鼠結腸癌C26小鼠中可以促進腫瘤的生長。
　　 (2)在C26、L929細胞沉默Bmal1基因后,通過下調生物鐘基因per1、per2、per3和抑癌基因p5

24、3、p21的表達,使抗癌藥物VP-16誘導的細胞凋亡減少。
　　 (3)沉默Bmal1基因后,通過上調cdc2、cyclin B1、cyclinD1、cyclinE導致C26、L929細胞增殖加快,G2/M期分布減少；在應用G2/M期阻滯藥Docetaxel后,G2/M期阻滯明顯減少。
　　 (4)在C26、L929細胞沉默Bmal1基因后,由抗癌藥物順鉑(DDP)誘導的細胞DNA損傷明顯減少。
　　 (5)生物