中期因子相互作用蛋白質研究.pdf

1、中期因子(midkine，MK)是一個由121個氨基酸組成的分子量約為1.kDa的堿性蛋白質，屬于肝素結合生長因子家族，其在人胚胎的肝、腎和腦部組織中高表達，但在健康成人體內表達量卻很低，然而在腫瘤患者體內表達量又會顯著地升高。研究發現MK在很多方面顯示與腫瘤發生有關的活性，包括促細胞增殖、轉化、血纖蛋白溶解、血管新生和抗細胞調亡等，但對其發揮一系列生物學功能的機理卻并不明了?；诘鞍踪|相互作用在生命活動的重要性，本碩士學位論文利用酵母

2、雙雜交技術篩選MK的相互作用蛋白質，為深入研究MK參與的分子途徑、闡明其發揮功能的分子機理打下基礎。
　　 我們首先將MK全長基因克隆至Invitrogen公司ProQuest酵母雙雜交系統的誘餌載體pDBLeu中，構建成功的pDBLeu-MK轉化酵母細胞MaV203，對該雙雜交系統的兩個報告基因lacZ和URA3分別進行檢驗后確定MK無自身轉錄激活能力。在此基礎上，通過小規模篩庫，確定在大規模篩庫中使用2.mM的3AT濃度以及

3、1.μgcDNA文庫量較為合適。在大規模篩庫后，我們從2×106數量的轉化子中篩選得到51個可能的陽性克隆。經過X-gal方法的檢驗，確定其中30個克隆呈陽性。抽提得到酵母陽性克隆的質粒，轉化大腸桿菌DH5α，用氨芐青霉素篩選獲得文庫質粒，測序并將結果在GenBank中進行BLAST序列比對，共得到6個不同的蛋白質。最后將篩選獲得的文庫質粒分別與pDBLeu和pDBLeu-MK共轉化酵母進行自身活性鑒定及活性再鑒定，并最終確定5個候選蛋

4、白，它們分別為Dvl-bindin.protei.nake.cuticle2(NKD2)、磷脂混雜酶1(phospholipi.scramblas.1,PLSCR1)、顆粒蛋白前體(progranulin，PGRN)和潛活TGF-β結合蛋白3，4(laten.transformin.growt.factorbet.bindin.protei.3an.4，LTBP-3.-4)。
　　 由于酵母雙雜交技術本身的缺陷，所得到的相互作用

5、蛋白質還需通過pulldown、FRET、co-IP等方法進行進一步驗證。因此在本論文的第二部分，我們采用了i.vitropulldown的方法來初步驗證篩選獲得的相互作用的真實性。首先我們將各個蛋白的全長基因克隆到體外表達載體pCMVTnT中，然后在Promega公司的TNT快速轉錄/翻譯耦聯系統中分別表達35[S]-甲硫氨酸標記的蛋白。將表達產物分別與原核表達純化的His-MK共孵育，利用特異性結合His標簽的鎳珠將孵育后的復合物沉

6、淀下來，并通過SDS-PAGE分離復合物，最后放射自顯影檢測35[S]-甲硫氨酸標記的蛋白是否被His-MK共沉淀下來，從而確定它們是否與MK發生相互作用。目前為止，我們利用此方法驗證了NKD2、PLSCR1、PGRN與MK能在體外發生直接的相互作用。
　　 在本研究中所篩選到的MK相互作用蛋白質有細胞外基質組分，也有胞內重要的信號分子，暗示中期因子可能參與的生物學過程的多樣性以及它在其中發揮作用的機制的復雜性。研究結果不僅為闡