羥基喜樹堿長循環納米粒及其兩親性載體的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 隨著上世紀70年代,Birrenbach等首次提出納米粒的概念和制備方法,藥物制劑的研究進入了一個全新的微觀領域--納米制劑。與常規藥物相比,納米藥物具有比表面積大、表面反應活性高、活性中心多、吸附能力強等特性,還可以改變藥物在體內的分布,增加藥物在靶器官的分布量,從而提高療效。但普通納米制劑靜注后,血漿中的多種成分(如載脂蛋白、補體C蛋白等)會吸附于納米粒的表面,使其易于被吞噬細胞識別,即機體的調理過程

2、(opsonization),被單核巨噬細胞吞噬系統(mononuclear phagocyte system,MPS)吞噬并迅速從血液中清除。因而如何避免MPS對納米粒的識別和吞噬是其能否被傳輸至其他器官或組織的關鍵。研究發現納米粒的表面特性如親脂性強弱、表面電位值等與調理素蛋白在其表面的吸附息息相關。一般來說納米粒的表面親脂性越強、表面電位值越低,調理素蛋白越容易吸附。由此可見納米粒的表面特性對制備長循環納米粒極為重要。目前針對納米

3、粒表面改性的研究主要集中在兩個方面:(1)在納米粒的表面包被親水性的聚合物或表面活性劑；(2)制備含親水性片斷的兩親性高分子載體材料,這些材料含有PEG、PEO、poloxamer、poloxamine、Polysorbate-80及Briji-35等。其共同點是能在納米粒親脂性內核的表面形成水化保護層(protective clouds)并具備一定的立體位阻效應,能抑制調理素蛋白在納米粒表面的吸附,即所制備的納米粒具有“隱形”(ste

4、alths)特性,從而使得納米粒不易被MPS識別,達到長循環目的。
　　 包被有poloxamer等表面活性劑的納米粒雖具備長循環的特質,但在體內微環境中,有學者認為血液中物質和包衣層物質間范德華力的存在容易引起包被層在體內循環中脫落,脫落的外源性物質作為一種外來性抗原對人體可能產生的潛在毒副作用值得關注并仍存在爭議；在兩親性高分子載體合成方面,目前文獻報道的共聚物幾乎均為AB型或者ABA型,其中包含有親水性的片段如PEG、PE

5、O等,具體的載體材料有PEG-PLGA、PEG-PLA及PEG-PHDCA等。其制備多是將PEG或單甲基取代的PEG分子、PEO等與乳酸分子單體或氰基烷酸酯等單體聚合反應而成,其反應條件要求苛刻如要求惰性氣體保護、反應管需融封、添加引發劑等。
　　 本課題直接選用適宜分子量的PEG和PCL為原料,琥珀酸酐為橋聯劑,制備含不同重復單元數量的PEG和PCL的兩親性共聚物載體材料。其中PCL為半結晶狀的高分子材料,選用它作為兩親性共聚

6、物載體的親脂性部分,既可以作為親脂性藥物的儲庫,其所含有的晶狀結構又有利于保持納米粒形態的穩定。PCL應用歷史悠久,如將其作為長效避孕藥體內埋植劑的載體材料、組織工程材料等；PEG安全無毒,已被FDA批準應用于臨床。本課題所選用的制備方法具有反應條件溫和、簡便易行和反應收率高等優點。
　　 羥基喜樹堿(10-hydroxycamptothecin,HCPT)是從珙桐科植物喜樹中提取的一種微量生物堿,是拓撲異構酶I的特異性抑制劑,

7、廣泛應用于肝癌、胃癌、白血病等多種惡性腫瘤的治療。但其特殊的理化性質:水不溶脂難溶、內酯環結構不穩定等因素,限制了臨床應用,普遍存在療效降低、半衰期短的缺點。本研究以HCPT為模型藥物,以兩親性的PEG-PCL多嵌段共聚物為載體材料,制備長循環納米粒(long-circulating nanoparticles),同時以脂質材料包裹的羥基喜樹堿半固體脂質納米粒制劑為對照組,通過體外釋放和大鼠體內藥代動力學試驗比較二者的長循環能力之間的差

8、異,旨在尋求一種新型的長循環制劑載體材料和制備HCPT長循環納米制劑。
　　 材料與方法
　　 1 HCPT-SSLN的制備與表征
　　 選擇固態和液態脂質為膜材,大豆磷脂為表面活性劑,采用乳化蒸發.低溫固化法制備了羥基喜樹堿半固體脂質納米粒(HCPT-SSLN)。以納米粒的外觀、粒徑、包封率為指標,分別考察了表面活性劑種類、固態脂質/液態脂質摩爾比、藥脂比、表面活性劑濃度、乳化蒸發攪拌時間、攪拌速度等因素對制備

9、的影響；在此基礎上,選定藥脂比、固態脂質與液態脂質的摩爾比、表面活性劑濃度為3個因素,進行3因素3水平正交設計優選處方。用Malvern激光粒度儀測定HCPT-SSLN的表面電位、粒徑及粒徑分布；透射電鏡觀察HCPT-SSLN的形態；建立了414nm處紫外分光光度法測定開環形式HCPT含量的方法,用葡聚糖凝膠柱層析-UV法測定HCPT-SSLN的包封率和載藥量。探討了不同冷凍保護劑對凍干HCPT-SSLN的影響,并對凍干制劑進行了穩定性

10、考察。以HCPT鈉鹽注射液作對比,選用昆明種小白鼠考察所制備的HCPT-SSLN的急性毒性。
　　 2 多嵌段PEG-PCL共聚物的合成研究
　　 選用適宜分子量的PEG和PCL為起始原料,琥珀酸酐為橋聯劑,合成多嵌段的PEG-PCL兩親性共聚物載體,并用FT-IR、1H-NMR、GPC、DSC、XRD分析對其進行表征；選用L969細胞株,以MTT和乳酸脫氫酶(LDH)活性指標考察所合成共聚物的生物相容性。
　　

11、 3 HCPT-PEG-PCL-NPs的制備與表征
　　 以共聚物為載體材料,Span60和Poloxamer 188為乳化劑和穩定劑,用共溶劑揮發法制備了羥基喜樹堿兩親性嵌段共聚物納米粒(HCPT-PEG-PCL-NPs)。以納米粒的外觀形態、粒徑、包封率、載藥量為指標,考察了Span/PEG-PCL的摩爾比、投藥量、Span/Poloxamer的摩爾比、攪拌速率、攪拌溫度、水相用量、水化時間等因素對制備的影響；在此基礎上,選

12、定PEG-PCL種類、投藥量、Span/Poloxamer的摩爾比、Span/PEG-PCL的摩爾比為4個因素,進行4因素3水平正交設計優化工藝。用Malvern激光粒度儀測定HCPT-SSLN的表面電位、粒徑及粒徑分布；透射電鏡觀察HCPT-SSLN的形態；建立了384nm處內酯形式存在的HCPT體外HPLC分析方法,用超濾離心-HPLC法測定HCPT-PEG-PCL-NPs的包封率和載藥量。探討了不同冷凍保護劑對凍干HCPT-PEG

13、-PCL-NPs的影響,并對凍干制劑進行了XRD分析和初步的穩定性考察。
　　 4 HCPT-NPs的體外釋放研究
　　 采用動態透析法,以pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液為釋藥介質,HCPT原料藥的水溶液為對照組,37℃恒溫避光恒速(100r/min)攪拌下進行HCPT-SSLN和HCPT-PEG-PCL-NPs的體外釋藥實驗。在設定的時間點上取樣測定其中的HCPT含量,計算累計釋藥量；采用不同的數學模型對不同納米制劑的體外

14、釋藥曲線進行擬合,探討其可能的釋藥機制。
　　 5 HCPT-NPs大鼠體內藥代動力學研究
　　 設定HCPT普通水針劑、HCPT-SSLN及4種兩親性共聚物載體材料制備的HCPT-PEG-PCL-NPs共6組；以54只Wistar大鼠為實驗動物(n=9),給藥劑量均為5mg/kg,經尾靜脈單劑量注射給藥后在設定的時間點上取血并測定HCPT的血藥濃度；建立了測定血漿中HCPT含量的HPLC方法,并繪制血藥濃度-時間曲線,

15、計算藥代動力學參數,對不同的HCPT-NPs的長循環作用進行評價和比較,優選最佳HCPT的長循環制劑及載體。
　　 結 論
　　 本研究所制備的HCPT-NPs均能有效增進HCPT在制劑中的溶解度,粒徑、形態、包封率與載藥量均達到制劑要求,凍干后復水性較好,動物急性毒性實驗安全。合成的多嵌段PEG-PCL共聚物經分析符合目標物質,有著良好的生物相容性。體外釋藥實驗中HCPT-NPs均具有一定的緩釋作用且符合Weibull