納米氧化銅和硫酸銅對豬SIEC細胞銅代謝酶影響的比較研究.pdf

1、銅是生物機體生命活動的必需元素，畜牧生產中由于高銅有促生長和抗菌等作用，刺激了養殖戶盲目的添加高銅，劑量控制不好就會導致動物機體中毒，同時大量沒有被機體吸收的銅排出體外造成環境污染。納米氧化銅由于尺寸小、活性高、易被動物機體吸收等特點成為一種可行性的銅源。本試驗通過SIEC細胞的培養，比較研究納米氧化銅和硫酸銅對細胞銅相關蛋白表達的影響，對納米氧化銅的代謝規律及其代替硫酸銅作為豬飼料銅源的可能性進行了探討。
　　 將凍存的SIE

2、C細胞解凍后常規培養，采用第5-8代細胞進行試驗。培養的細胞分為正常對照組、硫酸銅組、納米氧化銅組。硫酸銅組細胞培養液當中分別添加相同體積不同劑量的CuSO4·5H2O使其終濃度分別為5、10、20、40μg/mL CuSO4，納米氧化銅組細胞培養液當中分別添加相同體積不同劑量的納米氧化銅使其終濃度分別為5、10、20、40μg/mL。銅處理后細胞貼壁培養24h，采樣，ELISA方法測定MT含量，比色法檢測細胞CuZn-SOD活性，熒光

3、定量PCR檢測MT、CTR1、ATOX1、CuZn-SOD、COX17基因的表達量。細胞活性的檢測在銅處理細胞12h、24h、36h、48h、60h各個不同的時間段用MTT法檢測。
　　 腸上皮細胞為形狀不規則的單層柱狀上皮細胞。MTT試驗中銅處理細胞后，細胞生長表現出不同程度的抑制，其中10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL硫酸銅組影響更明顯。40μg/mL納米氧化銅和5μg/mL硫酸銅組可以顯著提高CuZn-SOD活

4、性(P＜0.05)，但是40μg/mL硫酸銅組比同劑量的納米氧化銅組和對照組活性降低(P＜0.05)。與對照組相比，納米氧化銅可以促進MT含量的升高(P＜0.05)，與同劑量的硫酸銅組相比，10、20、40μg/mL納米氧化銅組MT含量明顯升高(P＜0.05)。與對照組相比，10、20、40μg/mL納米氧化銅和硫酸銅劑量組對CTR1基因的表達表現出抑制作用(P＜0.05)，同劑量（10、20、40μg/mL）時添加納米氧化銅比硫酸銅對

5、腸上皮細胞CTR1基因抑制作用更明顯(P＜0.01)。20、40μg/mL硫酸銅組和40μg/mL納米氧化銅組金屬硫蛋白基因的表達量較對照組升高(P＜0.05)，其中10μg/mL的納米氧化銅組促進作用更明顯(P＜0.01)。10μg/mL、20μg/mL、40μ g/mL納米氧化銅組CuZn-SOD基因的表達量比對照組和同劑量的硫酸銅組顯著降低(P＜0.05);納米氧化銅和硫酸銅可以抑制ATOX1基因的轉錄(P＜0.01)，兩試驗組中

6、，5μg/mL銅添加劑量時硫酸銅組ATOX1基因表達量較低(P＜0.01)。添加納米氧化銅和硫酸銅對腸上皮細胞COX17基因表達量沒有顯著影響(P＞0.05)。
　　 硫酸銅在培養基中以銅離子形式存在，離子形式的銅進入豬腸上皮細胞主要是經CTR1轉運蛋白的攜帶。與硫酸銅相比，納米氧化銅在培養基中除了以離子形式存在外，還以納米粒子的形式存在，由于納米粒子的活性高可以通過細胞膜進入細胞，對轉運蛋白的依賴性較低導致豬腸上皮細胞基底側的

7、CTR1蛋白轉錄水平降低。進入腸上皮細胞后的銅一條途徑是與MT結合形成螯合物，由于納米氧化銅以兩種途徑進入細胞，導致銅流失減少，細胞內銅含量比硫酸銅組高，引起MT轉錄水平的表達量升高。進入細胞的銅需要適量的抗氧化酶拮抗銅對細胞的氧化作用，與硫酸銅組相比，納米氧化銅組更能有效地激活細胞內的抗氧化系統，表現為:進入細胞的銅除提高細胞中CuZn-SOD的活性外，在5μg/mL時通過促進ATOX1表達，促進銅離子代謝出細胞;在10、20、40μ