三磷酸甘油脫氫酶基因和甘油代謝對擬南芥種子含油量與根系發育的影響.pdf

1、種子含油量是油料作物研究的主要性狀之一。三酰甘油是油料作物種子中貯藏性油脂的主要形式。三酰甘油由三磷酸甘油作為骨架逐步與三個脂肪酸分子結合而成。前人對含油量的調控研究主要集中在參與脂肪酸合成與利用途徑中的有關基因，而很少有三磷酸甘油對種子油份積累的報道。三磷酸甘油在植物細胞中主要由兩條路徑產生，其一，甘油激酶磷酸化甘油產生三磷酸甘油;其二，三磷酸甘油脫氫酶將磷酸二羥丙酮加氫還原生成三磷酸甘油。近期研究表明，在種子中過表達酵母三磷酸甘油脫

2、氫酶基因能提高油菜種子含油量。甘油廣泛存在于微生物，動物和植物中。甘油代謝有關機制相對保守，其在微生物和藻類等已有較多報道，但在高等植物中有關甘油代謝對植物生長發育影響的報道較少。根系是高等植物的重要器官，也是植物發育生物學研究的模式器官之一。利用擬南芥研究甘油對植物根系生長發育將有助于甘油代謝機理的全面認識。
　　本研究包括兩方面的內容:第一部分是過表達甘藍型油菜三磷酸甘油脫氫酶基因對種子油份積累等性狀的影響;第二部分是利用甘油

3、代謝相關突變體與三磷酸甘油脫氫酶過表達材料比較外源甘油對擬南芥根系發育的影響，主要結果如下:
　　1、利用同源基因克隆法獲得了甘藍型油菜兩個GPDH基因。SouthernBlot分析油菜BnGPHp1克隆片段在甘藍、白菜和甘藍型油菜中的基因拷貝數分別為2個、2個和4個。氨基酸序列對比發現，BnGPDHs含有三磷酸甘油脫氫酶兩個典型的結構域，且與甘藍、白菜及擬南芥GPDHs基因氨基酸序列有高度同源性。生物信息軟件預測克隆片段BnGP

4、DHp1與BnGPDHc1分別定位于質體與胞質中。
　　2、基因表達分析顯示BnGPDHs在花、蕾中表達量較高，在根和莖中表達量較低，在發育的種子中均有表達。過表達BnGPDHp1轉化大腸桿菌甘油營養缺陷型菌株后重組菌系能在缺甘油的基礎培養基上生長。
　　3、構建BnGPDHs過表達載體并轉化擬南芥，對轉化家系進行插入拷貝數分析與目的基因表達分析，選取其中5個家系進行表型分析。發現多數過表達家系在種子重量、種子含油量同野生型

5、比較時增加差異并不明顯。構建Dsred-BnGPDHp1種子特異性過表達建構轉化擬南芥，選取轉基因后代陽性和非陽性種子進行比較，發現過表達家系在種子重量、種子含油量同非陽性對照比較無明顯差異。對過表達家系與對照在不同脅迫條件下處理后的鮮重和種子萌發率進行比較，顯示過表達BnGPDHp1增強了植物抗鹽脅迫能力。
　　4、鑒定了兩個甘油代謝有關純合突變體gpdhp1，gpdhc1，并利用這些突變體獲得了雙突變體gpdhc1gpdhp1

6、。RNA表達分析顯示目的基因在相應材料中均被敲除。種子重量比較發現，突變體gpdhc1比野生型要高，gpdhp1與野生型差異不顯著，雙突變體gpdhc1gpdhp1顯著下降。種子含油量比較發現，突變體gpdhp1比野生型要高，gpdhc1與野生型差異不顯著，雙突變體gpdhc1gpdhp1與無明顯差異。單粒種子油份比較發現，兩個單突變體比野生型顯著增加，但是雙突變體無明顯差異。
　　5、在梯度甘油條件下處理擬南芥幼苗，發現隨著甘油

7、濃度增加擬南芥根長生長逐漸受抑制。1mM甘油濃度以上根長抑制明顯，且側根數目顯著增加。在1mM甘油處理下甘油激酶突變體gli1根系變化不明顯，三磷酸甘油脫氫酶突變體gpdhc1和fad-gpdh的根長減少程度比野生型更明顯。過表達FAD-GPDH家系在甘油處理下根長不變或略有減少。
　　6、上述根系生長變化的表型同時伴隨著體內三磷酸甘油含量上升與無機磷含量下降。甘油處理下突變體gli1三磷酸甘油與無機磷含量沒有變化。三磷酸含量升高

8、引發野生型、gpdhc1和fad-gpdh突變體幼苗中的過氧化氫含量增加。過表達FAD-GPDH消除了處理下三磷酸甘油、無機磷含量和過氧化氫含量的變化，導致過表達植物對外源甘油耐受能力增強。這些結果說明甘油造成的根系生長變化與三磷酸甘油、磷和過氧化氫含量的改變有關，也說明FAD-GPDH基因在調控甘油代謝中發揮著重要作用。
　　7、甘油處理下游離IAA含量增加46％，DR5pro∷GUS在根分生區的中柱細胞著色增強，PIN1和PI