基于微流控技術的環境中金黃色葡萄球菌的檢測研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌是環境微生物的一種，廣泛的存在于自然界中。少量的金黃色葡萄球菌不會對環境產生影響，是正常的生物群落組成部分之一。但當其所在的環境適合其生長時，金黃色葡萄球菌將會大量繁殖，對該環境造成污染，并通過空氣、水等介質傳播，感染其中生物，導致多種疾病的產生，嚴重威脅到該環境中的其他生物健康，引發多種疾病甚至導致死亡，造成大量的經濟損失。金黃色葡萄球菌很容易隨著水體、空氣進入人體中大量繁殖，產生腸毒素。引起惡心、嘔吐、胃痙攣和腹瀉等中

2、毒癥狀，其中免疫力低下的人群如兒童和老年人其受感染，將會導致感染性休克或多器官功能衰竭，嚴重的可能導致死亡。不僅如此，金黃色葡萄球菌在傳播污染過程中極容易發生變異產生耐藥基因，引發嚴重的生物安全問題。
　　因此，檢測金黃色葡萄球菌的濃度變化，對保障環境安全以及避免環境遭受大面積的金黃色葡萄球菌污染、保障人類健康、及時有效的進行生物安全的防控以及環境預警等，都具有重大意義。目前有很多學者對環境類樣本中的金黃色葡萄球菌進行研究、檢測，

3、但是所用的方法大多為培養法。金黃色葡萄球菌作為生物性污染物的一種，有著能夠在短時間內自我生長、繁殖的特點。不同時間對同一份環境樣本中的金黃色葡萄球菌進行檢測，其結果數值有著巨大的差異。因此，對金黃色葡萄球菌進行快速在線實時分析的需求日益緊迫。
　　微流控技術是一種新興的技術，能夠將多種反應集成到一塊幾個平方厘米的芯片上完成，由于其效率高、成本低、分析時間短，并且能夠實現高通量、樣本結果一體化(Sample to answer)、便

4、攜化檢測，逐漸為了最佳的污染物檢測技術之一。
　　在本論文中，建立了兩類微流控體系，即分別為微流控—環介導等溫擴增(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)檢測體系以及微流控—免疫檢測體系，均能夠對金黃色葡萄球菌進行高效、快速、準確、低成本的實時監測。
　　在微流控—環介導等溫擴增檢測體系的建立中，首先設計并篩選出了一套能夠針對金黃色葡萄球菌nuc基因進行擴增的引物，建立了一個

5、宏觀的金黃色葡萄球菌環介導等溫擴增檢測體系，并用13種其他細菌作為陰性對照，對該體系的特異性進行驗證。然后將這個穩定的、高特異性的環介導等溫擴增體系整合在了微流控芯片中。所形成的微流控—LAMP體系將樣品的處理、金黃色葡萄球菌DNA的釋放、擴增以及結果的觀察集成在了一個長寬均為厘米級別的芯片中，能夠在一個小時左右，同時完成對4個樣本檢測。在將宏觀狀態下的環介導等溫擴增金黃色葡萄球菌檢測體系整合在微米級的管道中的同時，將整個反應體系從25

6、μL縮小到了1.5μL，因此采用此體系進行檢測大大減少了對試劑量的需求，同時也相應的減少了對樣本量的需求。本體系檢測限為10個DNA拷貝，比PCR反應低12個數量級。反應結果在365nm的紫外線下清晰可見。并且通過對芯片結構的優化，使得芯片體系制作簡單、容易操作，可以整合在便攜式、自動化的系統中。在實際應用中，可以實現直接在樣品采集地對樣本進行檢測，免去了樣本運送的麻煩。為驗證本體系的實用性和準確性，用此體系檢測了24例實際樣本，并與傳

7、統的培養法進行對比。采用本體系實時監測金黃色葡萄球菌的濃度，可以有效的避免其對所在的環境造成大規模污染，對環境中的金黃色葡萄球菌的防治起到了積極作用，保障人類健康不受其威脅，應用前景較為廣泛。為了適應大量樣本的檢測，在本研究中對上述的微流控—環介導等溫擴增進行了進一步的優化，優化的體系可以同時檢測12個樣本。并且通過對芯片設計的優化，使得操作更為簡單、方便。使用本體系對金黃色葡萄球菌進行檢測，降低了檢測成本以及試劑需求量，大大簡化了制作

8、過程以及操作過程，可以整合在便攜式、自動化的系統中
　　本論文還建立了一個微流控—免疫反應體系，可以在同一個體系中同時完成對8個樣品的檢測，所需時間不超過40min，并且驗證了芯片的特異性。相對于宏觀的檢測方法，本體系大大降低了樣本的檢測成本以及檢測時間。并且將檢測系統優化了以后，將能夠適用于在采樣現場的實時快速檢測。通過熒光強度的分析，可以定量的檢測樣本中金黃色葡萄球菌的濃度，進行簡單的環境學分析。通過利用本體系對實際樣本進行了

9、檢測，并用傳統的培養法做對照，進一步驗證了該體系的可行性和穩定性。該方法可以用于檢測養殖場廢水中金黃色葡萄球菌，為廢水處理方法的選擇提供了可靠的數據支持。本系統通過對養殖業廢水中金黃色葡萄球菌的實時檢測，在控制其對環境中水體、土壤以及禽畜之間的污染起到了積極作用。
　　本論文中所建立的兩個體系，原理不同，方式不同，但是均可以快速、準確、實時的、特異性的檢測金黃色葡萄球菌?？梢杂脙煞N體系對同一樣本進行檢測，通過對比檢測結果，相互進行