環境氧化應激誘發蛋白質(多肽)氧化損傷評價新方法的研究.pdf

1、環境問題是當前最重要的全球性問題之一。環境中的各種污染物對生態環境造成破壞的同時，也嚴重威脅著人類的健康與生存。外源性環境污染物可以通過呼吸道吸入、由食物鏈經消化道攝入和皮膚接觸等渠道進入生物體內，誘發機體發生環境氧化應激(氧化活性物質(ROS)的過量表達)，造成DNA/RNA、蛋白質、多肽、脂類等生物分子的氧化損傷?，F已證明環境氧化應激與諸多疾病有關，并且是引起疾病第二位的原因。因此，研究環境污染物誘發機體功能生物大分子的氧化損傷機理

2、，建立其快速、靈敏評價方法有助于人們了解環境污染物的致病機理和全面評價污染物毒性，為相關疾病的早期診斷、預防和治療提供科學依據。
　　 蛋白質是生物體各種功能的直接執行者。當其暴露于氧化應激的環境中時，ROS能夠誘發機體蛋白質分子結構的氧化性損傷和功能的消弱/喪失，進而導致諸多疾病的發生。因此，研究環境污染物對蛋白質的氧化損傷作用一直是環境污染與健康領域的熱門課題。
　　 本論文以分析化學、環境毒理學為背景，結合電化學、

3、高效液相色譜、質譜等實驗技術模擬研究了環境氧化應激誘發氨基酸、多肽、蛋白質的氧化損傷機理，并對氧化損傷的評價方法進行了探討。論文主要包括以下四部分：
　　 第一章闡述了各類污染物誘發環境氧化應激的途徑；歸納了環境氧化應激致氨基酸、多肽、蛋白質生物分子損傷的類型以及蛋白質氧化損傷與相關疾病的相關關系；介紹了蛋白質氧化損傷的分析與評價技術，蛋白質氧化損傷研究進展。在文獻綜述的基礎上分析了目前研究中存在的問題，提出了基于電化學循環伏安

4、、液相色譜-質譜聯用技術在模擬研究環境氧化應激誘發氨基酸、多肽、蛋白質的氧化損傷機理的評價方法。
　　 第二章選擇氨基酸、多肽、蛋白質作為電化學氧化損傷的靶分子，從分子水平上模擬研究其相應的界面氧化損傷機理，為機體蛋白質氧化損傷機理的深入研究提供了參考。
　　 1)利用電化學循環伏安技術模擬研究了胱氨酸、半胱氨酸在裸金電極上的氧化還原行為，探討了半胱氨酸的界面氧化損傷機理。研究結果表明(以金電極表面氧化為例)，正掃過程中

5、半胱氨酸有兩個特征氧化峰，0.65V附近的氧化峰對應于半胱氨酸氧化生成胱氨酸，0.85V附近的氧化峰對應于胱氨酸、半胱氨酸氧化生成CySOxH(x=2、3)；負掃過程半胱氨酸與多晶金形成Au-S鍵(該過程為失電子過程)，還原峰電流明顯降低且隨半胱氨酸濃度增加而逐步下陷。在此基礎上，研究了體系除氧、酸堿度、掃描速率、溫度等因素對半胱氨酸在電極上發生電化學氧化損傷過程的影響。該結果對于全面認識氧化應激條件下含硫多肽、蛋白質在生物膜表面的氧化

6、損傷機理及損傷修復提供了新的思路與方法。
　　 2)利用電化學循環伏安法模擬研究了還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽在金電極上的界面氧化還原行為。相對位阻較小的半胱氨酸、胱氨酸在金電極表面氧化過程，空間位阻比較大的還原型谷胱甘肽并未發生兩步的氧化過程，而是直接氧化生成GSOxH(難以生成氧化性的GSSG)。上述現象與普遍報道的GSH在環境氧化應激條件下生成GSSG的情況并不一致。這可能是由于GSH游離巰基兩側各自存在的一個氨基酸，使

7、得巰基在電極表面的氧化過程存在明顯的空間位阻作用。游離巰基之間的距離較大，無法形成二硫鍵(S-S)，因而只能生成GSOxH。該過程一定程度上類似于生物體線粒體膜、細胞膜等部位上發生的生物功能分子的氧化損傷過程，因而對于生物體膜上氧化損傷的研究，乃至相關疾病的研究都具有重要的意義。
　　 3)利用電化學循環伏安技術研究了牛胰島素在裸金電極上的氧化還原行為。通過與磷酸鹽緩沖液、胱氨酸和胰島素所含的其他氨基酸的電化學特征比較，胰島素的

8、電化學氧化損傷機理被詳細闡明：胰島素分子中的二硫鍵是其潛在的損傷位點并且其氧化產物為次磺酸(RSOH)、亞磺酸(RSO2H)以及磺酸(RSO2H)類化合物，但相對胱氨酸而言，由于空間位阻作用胰島素需要更為嚴苛的條件才能實現氧化；由于胰島素分子中二硫鍵S-SCYS6A，CYS11A和S-SCYS20A，CYS19B具有較小的溶劑接觸面積而難以氧化。因此，該研究條件下胰島素的主要氧化位點應為二硫鍵S-SCys7A-Cys7B。
　　

9、 第三章選擇多肽、蛋白質氧化損傷生成的羥基、亞砜產物作為準確表述蛋白質(多肽)氧化損傷位點、損傷程度的生物標記物，并利用液相色譜-質譜聯用技術及質譜碎片技術(LC-MS、LC-MS/MS)作為主要檢測技術，建立其定性、定量研究的新方法。
　　 1)利用液相色譜-質譜(LC-MS)、二級質譜(MS/MS)等技術研究了UV/H2O2誘發多肽氧化損傷位點、損傷程度及損傷機理，并探討了以多肽氧化損傷位點作為氧化損傷標志物的可行性。研究證

10、實UV/H2O2(模擬環境氧化應激條件)對目標多肽中的FMRF存在明顯的氧化損傷且損傷程度與時間正相關，并且LC-MS技術能夠實現損傷產物與未損傷多肽的快速分離和準確鑒定。因此，以多肽氧化損傷產物作為直接評價氧化損傷的新型標記物具有潛在優勢。本研究不僅拓展了多肽和蛋白質氧化損傷生物標記物的范圍，也為闡明多肽等功能分子氧化損傷位點、相應位點的氧化損傷程度以及氧化損傷機理的研究提了供一種準確高效評價的新方法。
　　 2)利用高效液相

11、色譜和串聯質譜技術建立了以靶蛋白細胞色素C氧化損傷位點和損傷程度作為氧化損傷標志物評價其氧化損傷機理的新策略。液相色譜-質譜聯用(LC/MS)和多肽指紋圖譜鑒定(MS/MS)技術分別被用于胰蛋白酶解多肽的分離檢測和UV/H2O2氧化損傷位點的定位研究。結合LC/MS和MS/MS實驗結果，可以確定酶解多肽C14AQC(heme)HTVEK22、C14AQCHTVEK22、E60ETLMEYLENPKK73、M80IFAGIK86、M80I

12、FAGIKK87中的Cys14、Cys17、Met65、Met80殘基是主要的氧化損傷位點。上述位點氧化損傷程度與氧化時間的正相關性證實以蛋白質氧化損傷產物作為評價其氧化損傷機理的可行性。
　　 3)利用60Co-γ射線輻照牛血紅細胞方式，模擬了環境氧化應激條件下過量表達的ROS對牛血紅蛋白的氧化損傷作用，通過高效液相色譜和串聯質譜技術建立了胞內血紅蛋白氧化損傷位點和損傷程度的評價方法。通過比較損傷前后血紅蛋白酶解的總離子色譜圖

13、及相應組分的MS/MS數據，發現靶分子的氧化損傷位點主要是部分暴露的氨基酸殘基(例如α-Phe36、β-Met1、β-Trp14)。氧化產物的定量分析表明，各損傷位點的氧化程度與氧化劑量正相關且受到氨基酸殘基類型和暴露程度控制。與傳統的蛋白羰基標記方法相比，本文所采用的方法為體外模擬條件下以及“體內”氧化應激實際存在時蛋白氧化損傷評價提供有效的技術支持。
　　 第四章最后對本論文的各研究部分進行了總結，并分析了蛋白、多肽等靶分子