納米技術在血紅蛋白自組裝及電化學傳感器中的應用基礎研究.pdf

1、21世紀，納米科學和技術已經成為人們關注和研究的重要領域。當物質的尺寸小到納米數量級時，會產生獨特的表面效應、體積效應、量子尺寸效應和宏觀量子隧道效應等，其電學、磁學、光學和化學性質也會相應地發生顯著變化，呈現出常規材料所不具備的優越性能。
　　 蛋白質和酶等生物大分子是構成生命的主要單元，參與完成生命體中的新陳代謝等許多生理過程，同時在這些生命過程中很多蛋白質和酶都要經歷電子轉移過程，在其氧化型和還原型之間相互轉化。從某種意義

2、上講，研究生命過程實質上就是研究生物體中的電子傳遞過程。因此，用電化學方法來研究蛋白質的電子傳遞過程有其特殊的優越性。
　　 氧化還原蛋白質在電極上的電化學研究是化學界和生命科學界非常關注的問題。它的研究對于人們獲得蛋白質的熱力學和動力學性質、深入認識蛋白質和酶等生物大分子在生命體內的生理作用及電子傳遞反應機制以及開發新型生物傳感器、新型生物燃料電池等生物電子器件具有重要意義。因此，尋找更有效的方法實現蛋白質的直接電子轉移、通過

3、研究蛋白質的電子傳遞以進一步揭示生物體系氧化還原過程的機制、構建性能優越的生物傳感器以滿足生物醫學、環境檢測和工業快速分析的需要，必將成為該領域今后的發展趨勢。
　　 納米材料具有高比表面積、高表面自由能以及優良的生物相容性等這些獨特的物理和化學性質，它能活化電極表面，滲透到蛋白質內部并接觸蛋白質的電活性中心，從而縮短蛋白質活性中心與電極表面的距離，加快直接電子傳遞的速度，同時能最大限度地保持蛋白質的生物活性。
　　 因

4、此，對納米界面上的生物大分子的直接電化學和電催化過程及其機理展開研究，以獲得一系列具有高靈敏度和超高選擇性的生物傳感器及其分子器件，可以為生命科學提供有價值的檢測手段，同時也能為揭示某些生物分子的生理功能提供科學信息。
　　 本論文的工作是導師顧海鷹教授主持的國家自然科學基金項目和作者主持的國家自然科學基金青年基金項目的部分工作內容，在對納米材料、氧化還原蛋白質的電化學研究及電化學生物傳感器等方面進行論述的基礎上，致力于研制新型

5、納米材料和納米修飾電極（電化學傳感器），以納米銀、殼核型磁性納米粒子、石墨烯等多種納米材料作為血紅蛋白的反應平臺，構筑可以加速血紅蛋白與電極間電子轉移過程的單層和多層組裝膜修飾電極。以電化學方法作為主要研究手段，結合多種表征方法，探討血紅蛋白在納米材料修飾電極上的電化學行為，既獲取了血紅蛋白電子轉移的動力學參數，也為研制無媒介體的生物傳感器提供了初步模型。另外，對基于血紅蛋白/納米粒子層層組裝膜的pH開關進行了初步的探索，實現了由溶液p

6、H值調控的可逆電催化。同時，開展了環境中酚類雌激素電化學傳感器的研究，建立了基于納米材料的新型電化學檢測方法，并將其應用于實際樣品的檢測，為環境科學及其相關領域的研究提供許多重要的分析方法。本論文工作努力實現將納米技術、生命科學和電分析化學三者的有機結合。主要結果如下：
　　 1.血紅蛋白在銀納米粒子上的自組裝、表征及應用
　　 將血紅蛋白(Hb）組裝在銀納米粒子(AgNPs)-殼聚糖膜修飾的玻碳電極表面，并基于該修飾電

7、極研究了Hb的直接電化學及其在生物傳感方面的應用。AgNPs能極大程度地提高Hb在電極表面的電子傳遞。在pH7.0的磷酸緩沖溶液(PBS)中，Hb呈現一對峰形良好的氧化還原峰，式量電位(Eo’)為-0.33V(vs.SCE)。固定在薄膜上的Hb保持了其生物活性，其電子轉移表現為一個表面控制過程，異相電荷轉移常數(Ks)為1.83s-1。在對氧氣(O2)和過氧化氫(H2O2)的電催化還原反應中表現出類過氧化氫酶的性質，對H2O2測定的線性

8、范圍為7.5×10-7-2.2×10-4mol/L，檢測限為5.0×10-7mol/L(S/N=3)。這種簡單的組裝方法可以為進一步研究其他氧化還原蛋白的直接電化學提供一個有利的平臺，并可用于構建第三代無媒介體的生物傳感器。
　　 2.血紅蛋白在金包四氧化三鐵納米粒子表面的直接電化學
　　 將合成的金包四氧化三鐵(Au@Fe3O4)納米粒子與Hb組裝在電化學預處理玻碳電極表面，構建了{Sb/Au@Fe3O4}自組裝膜。H

9、b在該納米薄膜上實現了其直接電子轉移。用透射電子顯微鏡(TEM)和原子力顯微鏡(AFM)對合成的Au@Fe3O4納米粒子進行了表征，用電化學交流阻抗(EIS)、循環伏安法(CV)研究了Hb和Au@Fe3O4納米粒子之間的相互作用。在pH7.0的PBS緩沖溶液中，在-0.35V和-0.13V處可觀察到Hb的一對峰形良好的氧化還原峰。另外，組裝的Hb對H2O2的還原表現出良好的電催化活性。催化電流與H2O2濃度在3.4μmol/L-3.6m

10、mol/L范圍內呈良好的線性關系，檢測限為0.68μmol/L(S/N=3)，米氏常數(Kmapp)約為2.0mmol/L，有望用于構建第三代H2O2生物傳感器。
　　 3.{血紅蛋白/鉑包四氧化三鐵｝n多層膜的構建、表征及應用
　　 利用層層組裝技術將合成的鉑包四氧化三鐵(Pt@Fe3O4)納米粒子與Hb層層組裝到玻碳電極表面，構建{血紅蛋白/鉑包四氧化三鐵｝n多層膜。合成的復合納米粒子通過X射線光電子能譜(XPS)來

11、表征。紫外可見光譜(UV-vis)，EIS，CV以及AFM用來表征多層膜的組裝過程，結果表明多層膜的形成是一個規則有序的過程。同時，{Hb/Pt@Fe3O4｝n多層膜中的Hb保持了其良好的生物活性，并實現了其與電極之間的直接電子轉移，且對H2O2和亞硝酸鹽保持著很好的催化活性。對H2O2與亞硝酸鹽的檢測的線性范圍分別為0.125μmol/L-0.16mmol/L和1.5μmol/L-0.12mmol/L，檢測限分別為0.03μmol/L

12、和0.29μmol/L(S/N=3)。實驗結果表明，層層組裝由于其組裝膜表面吸附了更多的生物分子，因而在構建高靈敏度的無媒介傳感器方面更有優勢。
　　 4.基于{血紅蛋白/銀納米粒子}n多層組裝膜的pH開關效應
　　 在合適的pH值下，將帶正電荷的Hb與帶負電荷的AgNPs交替吸附，構建了具有pH開關性質的層層自組裝膜。該{Hb/AgNPs}n膜對于電活性探針Fe(CN)63-具有很強的pH敏感開-關效應。在pH值為3.

13、0時，{Hb/AgNPs}4膜對于帶負電荷的探針Fe(CN)63-有電化學響應，表現為“開”的狀態，而在pH為9.0時，該多層膜對探針沒有響應，表現為“關”的狀態。完全可逆的開關行為可以簡單地通過調節溶液的pH值來實現，且該開關行為可以應用于pH控制的Hb對H2O2可逆電催化。實驗中構建的具有pH靈敏的開關智能界面有望為制備具有信號控制功能的特殊電化學生物傳感器提供一個新的思路。
　　 5.亞硝酸鹽在金包四氧化三鐵納米粒子上的電

14、催化氧化及其測定
　　 通過將Au@Fe3O4納米粒子固定在L-半胱氨酸修飾的玻碳電極表面構建一種亞硝酸鹽電化學傳感器，并用掃描電子顯微鏡(SEM)、XPS、EIS和CV進行表征。該傳感器對亞硝酸鹽的氧化具有良好的電催化活性。對電極反應過程的動力學參數進行計算，(1-a)na為0.38，ks為0.13cm/s。對測定條件如支持電解質及其pH值進行了優化。在優化條件下，亞硝酸鹽測定的線性范圍為3.6×10-6-1.0×10-2mo

15、l/L，檢測限為8.2×10-7mol/L(S/N=3)。此外，構建的電極在實際應用中顯示出良好的穩定性，重現性和選擇性。
　　 6.基于殼聚糖-四氧化三鐵納米復合物的雙酚A電化學傳感器
　　 研究了用殼聚糖-四氧化三鐵(CS-Fe3O4)納米材料修飾玻碳電極對雙酚A(BPA)進行安培測定。實驗中發現CS-Fe3O4復合納米粒子可以顯著增強BPA的電流反應，同時降低其氧化過電位。實驗優化了測定參數如修飾劑的量、富集電位、

16、富集時間及緩沖溶液的pH值等。在優化條件下，BPA的氧化峰電流與其濃度在5.0×10-8mol/L-3.0×l0-5mol/L范圍內呈良好的線性關系，檢測限為8.0×10-8mol/L(S/N=3)。將構建的傳感器成功地應用于塑料產品中BPA的測定，加標回收率在92.0％到106.2％之間。
　　 7.己烯雌酚在石墨烯修飾電極上的電化學行為及其測定
　　 將氧化石墨烯(GO)組裝在電沉積殼聚糖膜的玻碳電極表面，構建的修飾

17、電極對己烯雌酚(DES)進行了伏安測定。實驗研究了DES在該修飾電極上的電化學行為。與玻碳電極相比，DES在GO-CS/GCE上的氧化峰電流顯著增強。在優化條件下，修飾電極對于DES的氧化表現出良好的電催化活性。采用示差脈沖伏安法，測定DES的線性范圍為1.5×l0-8-3.0×l0-5mol/L，最低檢測線達到3.0×10-9mol/L。并用該方法測定了DES片劑中的DES含量。結果表明實驗提出的測定方法可用于實際樣品中DES的檢測。